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外泌體相關(guān)研究文獻(xiàn)分享,輕松讀完一篇文獻(xiàn)（十九）
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今天分享一篇發(fā)表在J Extracell Vesicles（2020年IF=25.83）上的文章，名為《Active cargo loading into extracellular vesicles: Highlights the heterogeneous encapsulation behaviour》[1]（活躍的貨物加載到細(xì)胞外囊泡：突出了異質(zhì)性的封裝行為）。

細(xì)胞外囊泡(EVs)是具有脂質(zhì)雙層外殼和包含生物分子的生物納米顆粒，來源于大多數(shù)細(xì)胞類型以調(diào)節(jié)細(xì)胞間通信。EV作為天然分泌的納米囊泡，因?yàn)槠涔逃械纳锵嗳菪�、合適的尺寸和固有的細(xì)胞靶向能力，在藥物傳遞領(lǐng)域顯示出了巨大的潛力。。迄今為止，已有幾項(xiàng)基于EV的臨床前試驗(yàn)研究了輸送蛋白質(zhì)、RNA或其他化療藥物治療疾病的能力。

盡管EV治療具有獨(dú)特優(yōu)勢，但仍有一些挑戰(zhàn)有待解決。使用EV作為輸送載體，穩(wěn)定封裝大量治療分子是先決條件。目前，主要載藥方法分為兩類：預(yù)裝載和后裝載。預(yù)裝載通過將小分子藥物與親本細(xì)胞共孵育，或轉(zhuǎn)染藥物編碼DNA到親本細(xì)胞，然后分離分泌的自然攜帶治療分子的EV。然而，這種方法僅限于培養(yǎng)細(xì)胞來源的EV，很難應(yīng)用于其他來源，如血漿或食物。對于后裝載的方法，藥物可在被動(dòng)或主動(dòng)刺激下，如孵育、超聲、凍融和電穿孔，載入純化的EV。盡管如此，與人工方法相比，上述所有方法都遇到了一個(gè)共同的問題：裝載能力較差，特別是對于親水分子的封裝。因此，開發(fā)更先進(jìn)的裝載方法來促進(jìn)治療藥物的封裝是基于EV的藥物給藥的重要環(huán)節(jié)。

此外，對貨物封裝行為的綜合評價(jià)對新型載藥方法的開發(fā)具有高度的指導(dǎo)意義，這往往被忽視。受限于技術(shù)的敏感性，目前大多數(shù)研究是通過從體積分析而不是單粒子基礎(chǔ)外推來評估加載能力。例如，一個(gè)常用的參數(shù)，封裝效率，被定義為整體納米載體合并載藥量與初始輸入的比率。然而，EV在顆粒大小和分子含量上自然異質(zhì)性，經(jīng)常被共沉淀蛋白和其他雜質(zhì)污染，從而導(dǎo)致藥物封裝不平等。因此，未知的異質(zhì)性需要在單粒子水平上進(jìn)行定量表征，以評估甚至純化載藥EV。

針對基于EV的給藥系統(tǒng)中的這些挑戰(zhàn)，我們提出了一種高效的載藥方法，名為“超聲和擠壓輔助主動(dòng)負(fù)載”(SEAL)，用于封裝可電離的親水藥物。以牛奶衍生EV(mEVs)和阿霉素(DOX)為模型系統(tǒng)，SEAL的藥物包封效率明顯高于傳統(tǒng)方法。此外，我們開發(fā)了一種用于評估加載行為的單粒子方法，其中引入了具有納米級靈敏度的流式儀(nFCM)來量化封裝效率并揭示異質(zhì)性。通過多參數(shù)分析，揭示了mEVs的封裝異質(zhì)性與成分方差之間的相關(guān)性，進(jìn)一步指導(dǎo)了純化過程中去除不需要的組分，提高純度。

研究結(jié)果：

一、用SEAL制備Dox-mEVs

基于跨膜離子梯度的活性載藥是脂質(zhì)體納米藥物藥物包封最高效的方法之一。受此啟發(fā)，我們提出了SEAL方法，以mEVs和阿霉素為模型系統(tǒng)，以增加EV的載藥能力(圖1a)。將mEVs在硫酸銨 ((NH4)2SO4)中重懸和超聲，以暫時(shí)滲透膜，促進(jìn)溶液流入管腔，以建立主動(dòng)加載所需的跨膜銨梯度。然后，進(jìn)行擠壓，縮小大的mEVs，使顆粒大小均一，重塑不利于載藥和遞送的非球形或多層囊泡。然后用PBS透析散裝溶液，然后用阿霉素孵育進(jìn)行活性負(fù)荷。

為了確定SEAL的效率，我們用TritonX-100對Dox-mEVs樣品進(jìn)行裂解，釋放管腔聚集的阿霉素，并檢測熒光信號(圖1b)。與被動(dòng)孵育相比，由于藥物封裝更有效，熒光強(qiáng)度增加了10.5倍。顯著的熒光猝滅，即釋放的和mEVs封裝的阿霉素之間的熒光強(qiáng)度比，進(jìn)一步證實(shí)了更多的藥物在SEAL制備的mEVs腔內(nèi)累積。在脂質(zhì)體模型中獲得了一致的結(jié)果，其中阿霉素封裝進(jìn)行了類似的過程。通過Western blot檢測SEAL過程前后mEVs上CD81、CD63、CD9、TSG101和HSP70的蛋白標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)超聲和擠壓處理沒有顯著影響mEVs的蛋白含量。

接下來，我們試圖優(yōu)化SEAL的技術(shù)參數(shù)，以改善載藥量。首先，我們發(fā)現(xiàn)SEAL過程的性能與鹽濃度和超聲時(shí)間高度依賴，在2-4min超聲和0.5-1M硫酸銨溶液條件下效率最佳(圖1c)。延長超聲處理時(shí)間或更濃縮的溶液都不能在不影響結(jié)構(gòu)完整性的情況下提高封裝效率。我們還研究了擠壓操作的影響，結(jié)果顯示，超聲處理后的3個(gè)擠壓循環(huán)足以減小mEVs的尺寸，提高封裝效率(圖1d)。使用沒有超聲處理的單獨(dú)擠壓處理的額外試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了擠壓過程確實(shí)促進(jìn)了mEVs膜上的溶液交換，并促進(jìn)了主動(dòng)加載過程。此外，根據(jù)不同濃度阿霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光校準(zhǔn)曲線，對不同藥物輸入下的加載濃度(mEVs加載阿霉素濃度)和封裝效率(mEVs封裝阿霉素與初始阿霉素輸入的比值)進(jìn)行量化。當(dāng)阿霉素的初始濃度低于0.5mM時(shí)，負(fù)荷濃度與藥物輸入之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系(圖1e)。隨著藥物輸入的不斷增加，負(fù)荷濃度保持不變，因?yàn)轭~外的阿霉素不再被限制在mEVs的腔體積。相應(yīng)地，在計(jì)算不同藥物輸入條件下的藥物包封效率時(shí)，則觀察到相反的趨勢。除藥物輸入的影響外，mEVs濃度與負(fù)載能力之間也存在正相關(guān)關(guān)系。

此外，與被動(dòng)孵育、超聲、凍融、電穿孔等傳統(tǒng)方法相比，驗(yàn)證了SEAL的加載能力(圖1f)。通過動(dòng)態(tài)光散射(DLS)測定了Dox-mEVs樣品的粒徑、多分散性指數(shù)和zeta電位，表明在載藥時(shí)沒有明顯的聚集或電荷逆轉(zhuǎn)(圖1f)。此外，采用透析袋法分析藥物釋放動(dòng)力學(xué)。與傳統(tǒng)的孵育方法相比，SEAL制備的Dox-mEVs樣品的延遲釋放譜驗(yàn)證了其增強(qiáng)的封裝穩(wěn)定性(圖1g)。

此外，通過透射電鏡觀察了Dox-mEVs的形態(tài)學(xué)特征(TEM，圖1h)。與未負(fù)載的mEVs相比，在SEAL制備的Dox-mEVs的囊泡核中觀察到一個(gè)代表阿霉素沉淀的電子密集結(jié)構(gòu)，這與脂質(zhì)體對應(yīng)物的特征一致。同時(shí)，透射電鏡圖像也顯示了mEVs與其他非囊泡粒子共存。為了解決SEAL的普遍性，一種化療藥物米托蒽醌(MXT)和一種核酸結(jié)合熒光染料吖啶橙(AO)也被積極地加載到mEVs中。

二、用nFCM對Dox-mEVs進(jìn)行單顆粒分析

考慮到TEM的過程耗時(shí)、分析通量低和潛在的成像偽影，應(yīng)用nFCM系統(tǒng)更徹底地揭示了異質(zhì)性，可對SEAL制備的Dox-mEVs負(fù)載能力的進(jìn)行定量。當(dāng)單個(gè)粒子依次通過nFCM的緊密聚焦的激光束時(shí)，同時(shí)檢測到側(cè)散射(SS)和阿霉素?zé)晒?FL-Dox)信號。圖2a顯示了通過被動(dòng)孵育和SEAL制備的Dox-mEVs的代表性SS和FL-Dox的信號。對于被動(dòng)孵育樣品，沒有顆粒有裝載足夠數(shù)量阿霉素可發(fā)射nFCM可檢測到的熒光信號(圖2a-i和ii)。對于SEAL制備的樣品，SS和FL-Dox通道上檢測到的峰代表了主動(dòng)負(fù)載的Dox-mEVs亞群，裝載了大量藥物。同時(shí)，沒有可檢測到的FL-Dox信號的粒子也同時(shí)存在，可認(rèn)為是非/負(fù)載較差的亞群。為了從單粒子的角度更定量地表征載藥能力，我們引入了一個(gè)稱為“活性載率”的參數(shù)，作為描述活性載亞群百分比的度量。根據(jù)1分鐘檢測得到的FL-Dox與SS的雙變量散點(diǎn)圖，計(jì)算出活性載率為18.2%，表明80%以上的顆粒不能主動(dòng)封裝阿霉素(圖2b)。此外，“主動(dòng)加載效率”，定義為阿霉素封裝在單個(gè)粒子的平均分子數(shù)，通過nFCM的單顆粒檢測結(jié)合總載藥量的總體檢測。如圖2b所示，測得顆粒濃度和總載藥含量分別為9.0×10^13顆粒/mL和162?M。結(jié)果表明，活性加載效率為每個(gè)顆粒1080個(gè)分子。假設(shè)與未/低負(fù)載亞群相關(guān)的阿霉素可以忽略不計(jì)，并且只考慮了主動(dòng)負(fù)載的Dox-mEVs進(jìn)行計(jì)算，則重新估計(jì)主動(dòng)加載效率平均在5934左右。此外，SS和FL-Dox強(qiáng)度分布的統(tǒng)計(jì)學(xué)代表性直方圖如圖2c所示。與未/負(fù)載差的亞群相比，主動(dòng)負(fù)載Dox-mEVs的亞群表現(xiàn)出增強(qiáng)的光散射，這要么是由于形態(tài)的改變，要么是由于藥物封裝后折射率(RI)的增加。此外，以二氧化硅納米顆粒為標(biāo)準(zhǔn)，可以進(jìn)一步分析這兩個(gè)亞群的尺寸分布。在熒光檢測方面，由于阿霉素積累顯著，主動(dòng)負(fù)載的Dox-mEVs的FL-Dox直方圖可以與大多數(shù)未負(fù)載不良的亞群區(qū)分開來(圖2c-ii)。總的來說，通過基于nFCM的單粒子分析，可以揭示和量化更全面的載藥行為。

考慮到未/低負(fù)載顆粒的顯著共存，采用超濾(UF)、尺寸排除色譜(SEC)和胰蛋白酶處理三種EV純化方法對Dox-mEVs樣品進(jìn)行了純化，并研究了其對活性負(fù)載率的影響。用nFCM測定了不同純化過程下兩個(gè)亞群的顆粒濃度，并據(jù)此計(jì)算了活性負(fù)載率(圖2d)。結(jié)果表明，SEC和胰蛋白酶處理能夠增加活性負(fù)載率，而UF純化則導(dǎo)致樣品的顯著損失。我們還記錄了SS和FL-Dox的強(qiáng)度，以確認(rèn)在純化過程中沒有明顯的藥物釋放或結(jié)構(gòu)破壞(圖2e)。除非另有說明，以下研究中使用的Dox-mEVs樣品均由SEC純化。

三、包封異質(zhì)性與脂質(zhì)包涵體的相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步闡明封裝異質(zhì)性與脂質(zhì)包涵等結(jié)構(gòu)特征的關(guān)系，采用雙激光和三檢測通道的nFCM進(jìn)行多參數(shù)相關(guān)分析。通過同時(shí)散射和熒光測量，通過親脂性碳氰染料DiD的熒光標(biāo)記，可以將脂質(zhì)包圍的囊泡與其他顆粒區(qū)分開來(圖3a)。通過SS和FL-DiD的的散點(diǎn)圖結(jié)果顯示，約50%的Dox-mEVs樣本為DiD陽性，代表脂質(zhì)包圍的囊泡(圖3b)。其中，還檢測到一小部分（～5.9%）的DiD陽性顆粒，只有背景水平的SS強(qiáng)度，可能是染料聚集物或其他低于檢測限的小顆粒(～40nm；圖3b左上)。FL-DiD與FL-Dox的雙變量點(diǎn)圖顯示，幾乎所有具有可檢測到的阿霉素信號的顆粒，即主動(dòng)負(fù)載的Dox-mEVs，都是DiD陽性的(>95%，圖3c)。因此，我們證明了只有具有脂質(zhì)包涵體的顆粒是可主動(dòng)加載的。同時(shí)，仍有37.6%的DiD陽性顆粒沒有檢測到FL-Dox信號(圖3c的左上)。為了更清楚地展示樣品的異質(zhì)性，我們生成了一個(gè)包含三個(gè)子集的維恩圖，顯示了Dox-mEV樣品中主動(dòng)負(fù)載、脂質(zhì)封閉和所有可檢測粒子的粒子數(shù)(圖3d)。此外，在表面活性劑輔助的破壞下，觀察到FL-Dox和FL-DiD通道的事件率同時(shí)降低，進(jìn)一步證實(shí)了脂質(zhì)包涵與活性藥物載量之間的直接相關(guān)性。

四、脂質(zhì)探針介導(dǎo)的Dox-mEVs的磁性純化

受上述結(jié)果的啟發(fā)，我們引入了脂質(zhì)探針介導(dǎo)的磁分離技術(shù)(LPMIT)，選擇性地去除非脂質(zhì)封閉顆粒，提高Dox-mEVs樣品的純度(圖3e)。脂質(zhì)探針DSPE-PEG-去硫生物素由一個(gè)帶有兩個(gè)疏水脂肪酸尾巴的聚乙二醇化脂質(zhì)用于膜插入和一個(gè)用于后續(xù)親和純化的去硫生物素標(biāo)簽組成。經(jīng)過“后插入”過程，去硫生物素標(biāo)記的顆�？梢员绘溍褂H和素包被的磁珠富集，并通過游離生物素的競爭性結(jié)合進(jìn)一步釋放。然后用nFCM對純化的Dox-mEVs樣品進(jìn)行表征，顯示活性負(fù)載率增加到63.2%(圖3f)。綜上所述，幾乎所有的活性可加載顆粒都是脂質(zhì)封閉的，因此，脂質(zhì)探針介導(dǎo)的純化可以純化Dox-mEVs樣品，增加活性加載率。

五、Dox-mEVs中酪蛋白成分的識別和去除

牛乳中含有大量酪蛋白，使mEVs的純化和應(yīng)用更加復(fù)雜。雖然酸沉淀已被證明可以有效去除大部分單體酪蛋白，但酪蛋白成分的潛在殘留很難完全消除。因此，將LPMIT純化的Dox-mEVs樣品用抗酪蛋白的熒光抗體進(jìn)行免疫標(biāo)記，并用nFCM進(jìn)行分析。在可檢測的事件中，免疫熒光陽性顆粒的百分比為～為33%，證實(shí)了酪蛋白成分的存在(圖4a)。通過對FL-Dox與酪蛋白(FL-Cas)免疫熒光的相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)超過85%的FL-Cas陽性顆粒不能主動(dòng)裝載阿霉素(圖4b左上)。同時(shí)，大多數(shù)主動(dòng)加載的亞群被確定為FL-Cas陰性(圖4b的右下)。通過整合相關(guān)信息，我們生成了一個(gè)維恩圖來說明LPMIT純化的Dox-mEVs樣品的異質(zhì)組成(圖4c)。為了去除所觀察到的酪蛋白成分并增加活性負(fù)載率，提出了一種免疫磁性分離技術(shù)(IMIT)(圖4d)。將磁珠與酪蛋白抗體偶聯(lián)，可以選擇性地去除這些組件，而不影響Dox-mEVs的結(jié)構(gòu)完整性。最后，純化的Dox-mEVs樣品的活性負(fù)載率進(jìn)一步提高到83.6%(圖4e)。需要注意的是，盡管活性負(fù)載率顯著增加，但由于在LPMIT過程中使用了過量的Dox-mEVs，超過70%的活性負(fù)載Dox-mEVs丟失。

六、負(fù)載mEVs的細(xì)胞毒性和細(xì)胞內(nèi)化分析

為了證明由SEAL制備的裝載mEVs的治療潛力以及樣品純度對整體治療性能的影響，我們進(jìn)一步進(jìn)行了一系列的細(xì)胞內(nèi)實(shí)驗(yàn)。首先，采用CCK-8法評估SEAL制備的Dox-mEVs樣品的細(xì)胞毒性。我們確定，空白mEVs的細(xì)胞毒性可以忽略不計(jì)，而Dox-mEVs表現(xiàn)出強(qiáng)大的細(xì)胞毒性反應(yīng)，比脂質(zhì)體對應(yīng)的更顯著(圖5a)。由于缺乏活性靶向部分來促進(jìn)HepG2細(xì)胞的積累，Dox-mEVs和Dox-LPs的體外細(xì)胞毒性低于游離阿霉素，這與之前的報(bào)道一致。然而，由于納米級尺寸分布和獨(dú)特的表面輪廓，EV配方可能具有更好的體內(nèi)治療效果。為了更好地說明SEAL方法的優(yōu)越性，在相同的藥物輸入下，也通過不同的加載方法實(shí)現(xiàn)了阿霉素的封裝，并平行評價(jià)了細(xì)胞毒性作用(圖5b)。使用相同的蛋白質(zhì)濃度，由SEAL制備的Dox-mEVs是確定EV劑量的一個(gè)常用參數(shù)，與其他方法相比，它表現(xiàn)出最顯著的細(xì)胞毒性。此外，經(jīng)上述過程純化的Dox-mEVs處理的細(xì)胞活力低于未純化的樣品，因?yàn)檩d藥率較高。

為了更好地分析細(xì)胞內(nèi)化行為，mEVs通過SEAL裝載AO，并通過NHS-胺反應(yīng)進(jìn)一步用熒光染料AlexaFluor647-NHS進(jìn)行標(biāo)記。將HepG2細(xì)胞與AO負(fù)載和AlexaFluor647-NHS標(biāo)記的mEVs(AO-mEVs-AF647)孵育后，使用共聚焦熒光顯微鏡可以觀察到綠色和紅色熒光(CFM，圖5c-i)�？紤]到天然mEVs不足的細(xì)胞靶向能力，通過先前開發(fā)的基于蛋白質(zhì)的修飾方法將廣泛使用的癌癥靶向配體轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合到AO-mEVs表面。與未修飾的mEVs相比，用轉(zhuǎn)鐵蛋白偶聯(lián)樣品(AO-mEVs-AF647-Tf)處理的HepG2細(xì)胞在AO和AF647通道上都顯示出更強(qiáng)烈的熒光(圖5c-ii)。熒光信號的明顯亞細(xì)胞定位，其中AO位于核部分，AF647主要位于細(xì)胞質(zhì)中，表明mEVs包裹的AO內(nèi)化后從囊泡腔中釋放出來。轉(zhuǎn)鐵蛋白偶聯(lián)后Dox-mEVs增強(qiáng)的細(xì)胞毒性，進(jìn)一步證實(shí)了配體促進(jìn)的內(nèi)化。

為了證明封裝異質(zhì)性對細(xì)胞內(nèi)化行為的影響，我們制備了磁性純化的AO-mEVs-AF647-Tf，并進(jìn)行了平行分析(圖5c-iii)。如CFM圖像所示，純化樣品的AF647熒光與未純化樣品的熒光沒有明顯差異，而當(dāng)使用相同的顆粒濃度處理細(xì)胞時(shí)，AO信號更強(qiáng)。未純化樣品的AO傳遞能力較差，是因?yàn)楦缓鞍踪|(zhì)的納米污染物也很容易被轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾，并通過受體介導(dǎo)的途徑內(nèi)化到宿主細(xì)胞中。因此，這種受體消耗效應(yīng)將導(dǎo)致在單個(gè)轉(zhuǎn)鐵蛋白內(nèi)化周期中，主動(dòng)負(fù)載亞群的攝取減少。

此外，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析也得到了類似但更定量的結(jié)果(圖5d和e)。根據(jù)細(xì)胞熒光強(qiáng)度，轉(zhuǎn)鐵蛋白偶聯(lián)的mEVs配方的AO遞送能力約為未經(jīng)修飾的對應(yīng)配方的4倍。經(jīng)過磁性純化后，這種差異進(jìn)一步擴(kuò)大（～10倍）。轉(zhuǎn)鐵蛋白偶聯(lián)也增加了AF647的強(qiáng)度，但在磁性純化后略有下降，這可能與AO-mEVs-AF647-Tf與其他納米污染物的標(biāo)記程度不一致有關(guān)。綜上所述，綜合結(jié)果證明了SEAL制備的mEVs制劑具有優(yōu)越的治療性能，并揭示了藥物封裝異質(zhì)性對治療結(jié)果的潛在影響。

文章就分享到這里，有興趣的話可以自己找這篇文獻(xiàn)具體看，有理解得不對的地方，歡迎專業(yè)人士指正，一起交流~

參考文獻(xiàn)：

[1]Chen Chaoxiang,Sun Mengdi,Wang Jialin,et al.Active cargo loading into extracellular vesicles: Highlights the heterogeneous encapsulation behaviour.Journal of extracellular vesicles.2021;10 (13)：e12163.doi:10.1002/jev2.12163

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