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zhby887061銅蟲 (初入文壇)
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干貨分享 | 炎癥性腸病動物模型的建立 已有2人參與
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炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD)是一種特發(fā)性、慢性反復(fù)發(fā)作的腸道炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)腹瀉、腹痛，甚至可有血便，臨床上主要疾病是潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病（Crohn disease，CD)。長期、反復(fù)的慢性腸炎，有可能導(dǎo)致結(jié)腸癌的發(fā)生。隨著現(xiàn)代生活方式的改變，炎癥性腸病已經(jīng)越來越普遍，其致殘率和致死率呈現(xiàn)持續(xù)的上升趨勢。 目前關(guān)于IBD確切發(fā)病機(jī)制尚不明確，研究指出，該疾病發(fā)展可能與遺傳、免疫失調(diào)、環(huán)境和腸道菌群等因素有高度相關(guān)。臨床上對IBD的治療效果并不理想，尋找治療IBD的新方法，提高IBD的治療效果，一直是近年來的研究熱點。 因此，建立IBD動物模型對于闡明IBD的病因和發(fā)病機(jī)制，從而達(dá)到有效防治的目的，具有重要的現(xiàn)實意義。目前已經(jīng)開發(fā)出動物模型，主要可以分為以下幾類： 其中又以化學(xué)誘導(dǎo)的IBD模型建立最為完善，由于它們的可靠性、重復(fù)性好、成本低且容易開發(fā)。下面詳細(xì)介紹： 01 化學(xué)誘導(dǎo)模型介紹 （一）醋酸誘導(dǎo)模型 造模機(jī)制：醋酸通過直接刺激腸黏膜，導(dǎo)致上皮壞死、血管損傷而使血管通透性增加；醋酸可激活激肽、促進(jìn)纖維蛋白水解而干擾凝血，并通過激活環(huán)氧合酶和脂氧合酶途徑而啟動炎癥的發(fā)生。 造模方法 Wistar大鼠，乙醚輕麻醉，將外徑2mm的聚乙烯導(dǎo)管從肛門插入結(jié)腸8cm處，緩慢注入3%醋酸2m，經(jīng)10秒完成注射，然后用5ml生理鹽水沖洗2次，保持仰臥、頭低腳高的位置30秒，以防止結(jié)腸內(nèi)液體流出。 5天后可見動物腹瀉、血便、體重下降、黏膜出血、上皮壞死、黏膜下水腫、中性粒細(xì)胞浸潤等，炎癥可逐漸延至固有層、黏膜下層甚至肌層。 模型特點：是一種暫時性的、非特異性的黏膜損害和急性炎癥，自愈性較強(qiáng)。其炎癥介質(zhì)與人類急性腸炎的炎癥介質(zhì)相似。不足之處是不能確切反映人類UC的免疫學(xué)變化，不能表現(xiàn)人類的UC所具有的慢性、復(fù)發(fā)的特點。 模型評估和應(yīng)用：該模型簡單易行，成本低，周期短，重復(fù)性好，成功率高。適用于研究人類UC的急性期、炎癥介質(zhì)致炎機(jī)制及藥物治療機(jī)制和黏膜愈合機(jī)制研究，不適于免疫機(jī)制的研究。 模型誘導(dǎo)成功的關(guān)鍵是醋酸的濃度和作用時間，以產(chǎn)生彌散性炎癥而不發(fā)生穿孔為宜。 （二）DSS誘導(dǎo)模型（本篇重點介紹） 葡聚糖硫酸鈉（Dextran Sulfate Sodium Salt，DSS）誘導(dǎo)的腸炎模型，是目前腸炎造模研究領(lǐng)域的金標(biāo)準(zhǔn)。該模型目前應(yīng)用比較廣，其炎癥表型與DSS注射的時間和劑量、小鼠的體重、品系和性別等研究得比較清楚。 DSS是葡聚糖的聚陰離子衍生物，由葡聚糖和氯磺酸的酯化反應(yīng)形成，分子式為 (C6H7Na3O14S3)n，市售DSS分子量500-140000不等，常溫下極易溶于水，常用的造模分子量為36000-50000Da。 DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型的機(jī)制仍未十分明確，目前的研究主要認(rèn)為DSS增加腸道通透性、破壞腸黏膜屏障、上調(diào)某些細(xì)胞因子（腫瘤壞死因子、白介素、干擾素、IL-10和IL-12）、激活某些通路（NF-κB通路和TRPV1通路）或腸道菌群失調(diào)等有關(guān)。 造模方法 準(zhǔn)備： 6-8周 C57BL/6，雌雄各半（適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，并可自由飲水和進(jìn)食）； 無菌水；DSS（分子量36000-50000Da） 實驗步驟： （1）將DSS溶于蒸餾水中，配置成2%-5%（w:v，根據(jù)不同實驗室的飼養(yǎng)條件以及不同的動物品系等可選擇最佳飲用濃度）的DSS水溶液，然后用0.22μm的濾膜過濾。DSS溶液配制好完成后可在4℃避光保存。 （2）小鼠標(biāo)記并稱取基準(zhǔn)體重。 （3）通過給予動物自由飲用不同濃度的DSS水溶液，根據(jù)用藥時間及用藥周期可制成急性和慢性兩種結(jié)腸炎模型。 ① 急性腸炎 給待造模動物飲用DSS溶液(2％～5％)5-7d，該階段不給予任何其他水源；對照組則飲用經(jīng)過滅菌的蒸餾水。每天觀察動物的一般情況，飲水量，體重，大便性狀，以及是否有便血。計算動物每天的體重降低百分比，公式如下：[(體重—基準(zhǔn)體重)/基準(zhǔn)體重]×100。 喂食第7天時，處死動物，解剖取腸道組織，并做病理切片，HE染色。 急性結(jié)腸炎造模也是常用的結(jié)腸炎模型之一，因其制備簡單、成功率高，且與人類UC病變相似，是研究UC發(fā)病機(jī)制和評估藥物療效較為理想的模型。急性造模一般采用較高濃度的DSS建立，給藥時間較短。 急性期結(jié)腸炎模型表現(xiàn)：結(jié)腸充血、水腫、變短、變脆、重量長度比增加，出現(xiàn)不同程度的結(jié)腸潰瘍，黏膜水腫、杯狀細(xì)胞缺失、隱窩腫脹破壞，黏膜和黏膜下層出現(xiàn)不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤，上皮細(xì)胞損傷。 ② 慢性腸炎 給待造模動物飲用DSS溶液(2％～5％)5-7d，第8天將DSS溶液更換為不含DSS的清水，清水?dāng)z取持續(xù)14天后，重復(fù)前面的步驟2-4次。每天觀察動物的一般情況，飲水量，體重，大便性狀，以及是否有便血。計算動物每天的體重降低百分比，公式如下：[(體重—基準(zhǔn)體重)/基準(zhǔn)體重]×100。 在最后一個循環(huán)周期的最后一天，處死動物，解剖取腸道組織，并做病理切片，HE染色。 慢性結(jié)腸炎模型則可采用低濃度DSS建立，但給藥時間較長，如給予小鼠1%~3% DSS自由飲用數(shù)個星期即可。 慢性結(jié)腸炎模型表現(xiàn)：小鼠結(jié)腸明顯縮短，上皮增生、黏膜纖維化和淋巴結(jié)腫大；小部分動物可見肉芽組織增生和腫瘤樣改變。 模型優(yōu)勢 （1）DSS誘導(dǎo)的UC模型的病理改變與人類UC最相似； 自從1985年報道日本學(xué)者首次采用葡聚糖硫酸鈉(DSS)制備出倉鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型后，已有大量數(shù)據(jù)證明DSS結(jié)腸炎模型的病因、臨床癥狀、病理改變及治療應(yīng)答均與人類潰瘍性結(jié)腸炎相似。 （2）周期可長可短，能夠模擬急性腸炎，慢性腸炎以及腸炎修復(fù)模型； （3）采用自由飲用DSS水溶液的方法建立動物模型，將造模時人為因素的干擾降至最小。方法簡便易行，實驗重復(fù)性強(qiáng)且造價較低,已成功在多種屬動物中成功造模 （4）用不同的DSS溶液濃度、給藥時間和給藥頻率，可制成急性和慢性兩種結(jié)腸炎模型。模型持續(xù)時間長，體現(xiàn)了急性向慢性轉(zhuǎn)化的動態(tài)過程，解決了UC的慢性化和維持問題，這是許多模型無法比擬的。 模型應(yīng)用 DSS模型多用于UC發(fā)病機(jī)制研究和大多數(shù)藥物治療藥效研究，但不適合T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的研究。 DSS誘發(fā)結(jié)腸炎模型的常見用途包括：研究先天免疫系統(tǒng)如何參與腸道炎癥，以及尋找在損傷期間/之后維持或重建上皮完整性的重要環(huán)節(jié)。 DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型也對環(huán)孢菌素A有響應(yīng)，因此可以用來評估針對相同免疫機(jī)制的新藥，例如新的免疫抑制劑。 （三）TNBS誘導(dǎo)模型 三硝基苯磺酸（trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）本身不具有抗原性，但與宿主蛋白結(jié)合后會引起免疫反應(yīng)，因此屬于半抗原。常和乙醇、醋酸等合用。 TNBS處理小鼠可建立模擬臨床克羅恩氏�。–D）的臨床前模型，其產(chǎn)生的免疫反應(yīng)是Th1介導(dǎo)的，特征在于CD4+T細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤，形成橫向進(jìn)展的炎癥，導(dǎo)致透壁結(jié)腸炎。 TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型非常適合研究CD的免疫學(xué)，也可以用于測試新免疫療法的療效，但不適用于對免疫機(jī)理的研究和對療程較長藥物的藥效觀察。 造模方法 動物：6-8周BALB/c小鼠。 試劑：TNBS、橄欖油、無水乙醇、丙酮、1mL注射器、軟管（可用膽汁插管的軟管）、渦旋儀 試劑配制：首先將TNBS溶于水，配制成5%TNBS（w:v）水溶液，然后配制橄欖油與丙酮比例為1:4（v:v）的均勻混合溶液，使用該混合液將5%的TNBS稀釋為1%的TNBS溶液（或首先將TNBS溶于水，配制成5%TNBS（w:v）水溶液，然后使用無水乙醇將5%的TNBS稀釋為1%的TNBS溶液）。 造模：小鼠背部去毛（1.5x1.5 cm），取配制好的1%的TNBS溶液150 μL均勻涂抹在去毛位置，七天后，動物稱重并標(biāo)記，小鼠麻醉后使用1ml注射器通過軟管將100 μL的1%TNBS緩慢注射進(jìn)入小鼠直腸內(nèi)（軟管插入直腸的長度大約4 cm），小鼠倒立保持約1 min，然后將動物放置回籠內(nèi)，造模后持續(xù)觀察動物狀態(tài)，通過DAI評分判定動物成模情況。 （四）惡唑酮誘導(dǎo) 惡唑酮也屬于半抗原，但會引起與TNBS誘導(dǎo)不同的炎癥反應(yīng)，它誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)是Th2介導(dǎo)的，會導(dǎo)致彌漫性結(jié)腸炎癥。該模型用于研究皮膚中的遲發(fā)型超敏反應(yīng)，也用于評估靶向Th2介導(dǎo)機(jī)制的藥物。 造模方法 實驗動物：6-8周BALB/c小鼠 試劑：惡唑酮、橄欖油、無水乙醇、丙酮、1mL注射器、軟管（可用膽汁插管的軟管）、渦旋儀 試劑配制： 配制橄欖油與丙酮比例為1:4（v:v）的均勻混合溶液 用水稀釋無水乙醇得到50%乙醇 稱取一定量的惡唑酮，使用橄欖油/丙酮混合液溶劑，配置成3%的噁唑酮給藥溶液（或者用50%的無水乙醇配制得到1%的惡唑酮給藥溶液）。 造模： 小鼠背部去毛（1.5×1.5 cm），取配制好的1%惡唑酮溶液（50%乙醇溶解）150 μL均勻涂抹在去毛位置，七天后，動物稱重并標(biāo)記，小鼠麻醉后使用1ml注射器通過軟管將100 μL的惡唑酮給藥溶液緩慢注射進(jìn)入小鼠直腸內(nèi)（軟管插入直腸的長度大約4 cm），小鼠倒立保持約1 min，然后將動物放置回籠內(nèi)，造模后持續(xù)觀察動物狀態(tài)，通過DAI評分判定動物成模情況。 02 模型評估指標(biāo) 1)疾病活動指數(shù)（DAI）的評估 每天觀察動物體重、大便性狀和隱血情況，按照下表進(jìn)行評分，將各項評分相加，得出每只動物的DAI，以評估疾病活動情況。 正常大便：成形大便；松散大便：不粘附與肛門的糊狀、半成形大便；稀便：可粘附與肛門的稀水樣便。（來源：小鼠葡聚糖硫酸鈉急性潰瘍性結(jié)腸炎模型的建立和評價） 2)組織學(xué)損傷指數(shù)（HI）的評估 觀察結(jié)腸內(nèi)有無出血，潰瘍等。取一小塊組織常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，觀察組織學(xué)改變并按照下表進(jìn)行評分，HI用黏膜損傷程度及范圍積分的和來表示。 3)病理切片（HE染色）觀察 對照組：結(jié)腸黏膜完整，黏膜上皮完整，腺體排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)清楚，無炎癥細(xì)胞浸潤及潰瘍。DSS實驗組：結(jié)腸黏膜破壞，腺體排列不規(guī)則甚至消失，炎性細(xì)胞浸潤，腺體膿腫，潰瘍等。（DOI：10.1016/j.jnutbio.2020.108438） 4）其他，如過氧化物酶（MPO）的活性分析、促炎性細(xì)胞因子的測量分析 不同的誘導(dǎo)劑對應(yīng)不同的臨床適應(yīng)癥，我們可以根據(jù)實驗需要、技術(shù)能力選擇相應(yīng)的模型。在研究中，還應(yīng)始終確保使用相同的方案，以確保實驗可重復(fù)性，化學(xué)品批次、動物品系、性別、來源、化學(xué)供應(yīng)商、劑量、頻率和持續(xù)時間都可能影響到造模的重復(fù)性。 |
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