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多肽的純度與多肽的凈含量
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一、多肽的純度 多肽的純度是指HPLC方法在214nm處檢測到的目標多肽的含量(214nm是肽鏈的吸收波長)，紫外分光光度計檢測不到水和殘留的鹽份�？砂l(fā)現(xiàn)其他的雜質(zhì)包括：缺失序列（缺失了一個或多個氨基酸殘基的靶序列），截斷序列（加帽過程中產(chǎn)生的序列）脫保護不完全序列（產(chǎn)生于整個合成過程或最后的裂解過程）。 多肽純化不涉及水和鹽。HPLC純化會產(chǎn)生少量的TFA，如：游離的氨基末端和其他側(cè)鏈如Arg、Lys、His都可生成少量TFA雜質(zhì)。通常交付的多肽多含有微量TFA和殘留水。即使處于凍干狀態(tài)，水也會因共價結(jié)合的能力不同而不同程度地存在著。 在多肽中還存在哪些其他物質(zhì)(雜質(zhì))? 雜質(zhì) 純化前的多肽 純化后的多肽(HPLC) 缺失序列1 ✓ ✓ 截斷序列2 ✓ ✓ 脫保護不完全序列3 ✓ ✓ 裂解過程中被修改的序列4 ✓ ✓ DTT (dithiothreitol，二巰基蘇糖醇) ✓ ☓ TFA (trifluoroacetic acid，三氟乙酸) ✓ ✓ Acetic acid（醋酸） ✓ ☓ 某個氨基酸發(fā)生了副反應(yīng)的多肽，如脯氨酸異構(gòu)化等。 ✓ ✓ 純化前的多肽中包含的雜質(zhì)包括多肽和非多肽物質(zhì), 純化后的多肽中包含的雜質(zhì)除了TFA鹽，大多數(shù)為序列被修改的多肽。 1、缺失了一個或多個氨基酸殘基的靶序列 2、為避免缺失序列的產(chǎn)生而進行的加帽操作，截斷序列即產(chǎn)生于加帽過程中產(chǎn)生于整個合成過程或最后的裂解過程 3、保護基重新附著在多肽的其他位置 二、多肽凈含量 肽凈含量不同于多肽純度，多肽純度僅指多肽本身所含肽產(chǎn)品的含量及雜質(zhì)的含量，不包括水份等雜質(zhì)。而多肽含量則是指樣品中肽類物質(zhì)相對于非肽類物質(zhì)所占的百分比。通常一條多肽產(chǎn)品中除了多肽本身還包括生產(chǎn)過程中帶入的非鹽組份，如水，被吸收的溶劑、配位離子和鹽等。即使在嚴格的凍干狀態(tài)下，也會吸收微量的水。因此一條多肽即使純度達到99%，因為產(chǎn)品中還包含水份及有機鹽分等，它的含量可能也只有70-80%。因純化批次和凍干工藝不同，也會導致肽的凈含量有所不同。一般我們可以用N元素分析或氨基酸分子的方法來檢測多肽的凈含量。如果多肽序列中有Trp或Tyr可以采用紫外的方法分析肽含量，根據(jù)摩爾消光系數(shù)： Tryptophan 5560 AU/mmole/ml Tyrosine 1200 AU/mmole/ml （at 280 nm at neutral pH using a 1-cm cell） 一條多肽的摩爾消光系數(shù)可以根據(jù)每個Trp或Tyr的系數(shù)進行加和，然后根據(jù)所測到的在280nm處的吸收值通過公式進行計算 mg peptide per ml = (A280 x DF x MW) / e A280 在280 nm實際吸收值（1-cm cell）, DF 是稀釋因數(shù), MW 多肽分子量 e 多肽的摩爾消光系數(shù) |
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