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逸漠國榮銅蟲 (正式寫手)
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A549細(xì)胞培養(yǎng)教程
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A549人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系由D.J.Griad通過肺癌組織移植培養(yǎng)建系，患者為58歲白人男性。A549細(xì)胞能通過胞苷二磷酸膽堿途徑合成含有高含量不飽和脂肪酸的卵磷脂。 產(chǎn)品參數(shù) 01 A549細(xì)胞基本信息 A549人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 名稱：A549人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 年齡：男，58歲 來源：肺 特性：貼壁生長 形態(tài)：上皮細(xì)胞樣 支原體：無 推薦傳代比例：1:2-1:3 推薦換液頻率：2~3次/周 凍存液：無血清凍存液，液氮儲存 規(guī)格：1x10^6cells/T25或1mL凍存管 倍增時間：~22 小時 保藏機構(gòu)：ATCC 培養(yǎng)條件氣相：95%空氣+5%二氧化碳；溫度：37℃ A549細(xì)胞培養(yǎng)基 90%DMEM+10%FBS+1%PS A549細(xì)胞STR鑒定 A549細(xì)胞STR鑒定報告圖 到貨處理 02 A549細(xì)胞收貨處理 復(fù)蘇細(xì)胞T25瓶 復(fù)蘇A549細(xì)胞 1.收到A549細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生及時和我們聯(lián)系； 2.用75%酒精消毒瓶壁，將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置2-4h，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)； 3.給收到的細(xì)胞拍照(10x,20x)各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為細(xì)胞需要售后時提供收到細(xì)胞時細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。 凍存細(xì)胞凍存管 凍存A549細(xì)胞 1.收到A549細(xì)胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈，凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請立即拍照并與我們聯(lián)系； 2.為保證細(xì)胞的高存活率，收到細(xì)胞后，需立即轉(zhuǎn)入液氮凍存或直接復(fù)蘇。 收貨注意事項 1.如果使用培養(yǎng)瓶，在將其放入培養(yǎng)箱前，應(yīng)將封口膜去掉，瓶蓋旋松，以便進行充分的氣體交換。 2.仔細(xì)閱讀細(xì)胞說明書，了解細(xì)胞相關(guān)信息，如細(xì)胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細(xì)胞因子等，確保細(xì)胞培養(yǎng)條件一致。 培養(yǎng)指南 03 A549細(xì)胞培養(yǎng)操作說明 ►►► A549細(xì)胞復(fù)蘇步驟 將含有1 mLA549人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6 cm皿中，加入約4 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。 第二天換液并檢查細(xì)胞密度。 請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng) ►►► A549細(xì)胞傳代操作 如果A549細(xì)胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng) a.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。 b.加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有A549人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2 min（視細(xì)胞情況而定），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加2-3ml完全培養(yǎng)基終止消化。輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心5 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。 c.將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 ►►► A549細(xì)胞凍存步驟 待A549細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進行細(xì)胞凍存。下面 T25 瓶為例 1.收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，然后進行細(xì)胞計數(shù)。 2.根據(jù)A549人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞數(shù)量對應(yīng)加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×10^6~1×10^7/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。 3.將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。 ►►► 溫馨小貼士 1.運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。 2.收到細(xì)胞后第一次傳代建議1：2傳代 。 常見問題 1、何時須更換培養(yǎng)基 視細(xì)胞生長密度而定，常規(guī)細(xì)胞2-3天更換培養(yǎng)基。 2、何時進行傳代 細(xì)胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。 首次傳代建議1：2傳代，就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿。不是1個T25瓶傳2個10cm皿。 3、細(xì)胞凍存濃度是多少 1*10^6-1*10^7之間都可以。 4、凍存細(xì)胞數(shù)量計算 如果是有要求每管要凍多少細(xì)胞，那就用1ml完培重懸后，取部分按平時方法計數(shù)，剩下的細(xì)胞按計數(shù)需要的細(xì)胞量凍存即可。 如果沒要求，那就按平時，一個皿凍一管。 5、離心速率應(yīng)為多少 細(xì)胞傳代或凍存時欲回收細(xì)胞，其離心速度一般為800-1000 rpm/min，室溫離心5-8分鐘，轉(zhuǎn)速過高，將造成細(xì)胞破裂死亡。 6、可否使用與原先不同培養(yǎng)基 不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)，易造成細(xì)胞狀態(tài)不好，最終造成細(xì)胞無法存活。 7、可否使用與原先不同血清種類 不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對于細(xì)胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細(xì)胞無法存活。 微信截圖_20220519172131.png |
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