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小柴不拆
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[交流]
原創(chuàng)筆記|小談Transwell細胞遷移實驗
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實驗介紹 細胞遷移與侵襲實驗將 Transwell 小室放入培養(yǎng)板中,小室內(nèi)稱上室,培養(yǎng)板內(nèi)稱下室,上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔,將研究的細胞種在上室內(nèi),由于聚碳酸酯膜有通透性,下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細胞,應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜,就可以進行共培養(yǎng)、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研究。 實驗步驟 一、材料準(zhǔn)備 可拍照顯微鏡,Transwell小室,孔徑8μm,沒包被膠的(Coster和Corning公司的也較常用),Transwell遷移實驗的細胞培養(yǎng)板24孔板。細胞培養(yǎng)板應(yīng)當(dāng)與購買的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,無血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM和1640培養(yǎng)基,DMEM完全培養(yǎng)基,1640完全培養(yǎng)基(也可加到20%血清),無菌PBS,棉簽,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,結(jié)晶紫染液(0.1%(g/ml)PBS結(jié)晶紫) 二、步驟和流程 2.1基質(zhì)膠鋪板 用BD公司的Matrigel 1:8(根據(jù)細胞產(chǎn)生mmp的量來決定)稀釋,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝膠。使用前進行基底膜水化。 2.2制備細胞懸液 ①制備細胞懸液前可先讓細胞撤血清饑餓12-24h,進一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。 ②消化細胞,終止消化后離心棄去培養(yǎng)液,(用PBS洗1-2遍),用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細胞密度至5×105/ml。 2.3接種細胞 ①取細胞懸液100μl加入Transwell小室。 ② 24孔板下室一般加入600μl含20S的培養(yǎng)基,特別注意的是,下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生,一旦產(chǎn)生氣泡,下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了,在種板的時候要特別留心,一旦出現(xiàn)氣泡,要將小室提起,去除氣泡,再將小室放進培養(yǎng)板。 ③培養(yǎng)細胞:常規(guī)培養(yǎng)12-48h(主要依癌細胞侵襲能力而定)。24h較常見,時間點的選擇除了要考慮到細胞細胞侵襲力外,處理因素對細胞數(shù)目的影響也不可忽視。 2.4結(jié)果統(tǒng)計 直接計數(shù)法,“貼壁”細胞計數(shù),這里所謂的“貼壁”是指細胞穿過膜后,可以附著在膜的下室側(cè)而不會掉到下室里面去,通過給細胞染色,可在鏡下計數(shù)細胞。 取出Transwell小室,棄去孔中培養(yǎng)液,用無鈣的PBS洗2遍,甲醇固定30分鐘,將小室適當(dāng)風(fēng)干。 0.1%結(jié)晶紫染色20 min,用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞,用PBS洗3遍。 400倍顯微鏡下隨即五個視野觀察細胞,記數(shù)。 |
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