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小柴不拆
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科研干貨|13種蛋白提取方法，趕快收藏手慢無！（三）
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核基質(zhì)蛋白提取Procotol 1、細(xì)胞計(jì)數(shù)（約1×10^7的細(xì)胞），離心（1100rpm×5min）收集細(xì)胞； 2、用4℃預(yù)冷的PBS重懸，轉(zhuǎn)至1.5mlEP管中，1×PBS洗一遍； 3、加300ulRIPA1×10^7的細(xì)胞，裂解細(xì)胞，至冰上15-30min， RIPA+PMSF（1:100）+Cocktail（1:1000） 4、4℃預(yù)冷離心：13000rpm×10-15min； 5、將離心后的上清轉(zhuǎn)移至新的已4℃預(yù)冷的1.5mlEP管中，冰上備用（總蛋白）； 6、用1×PBS洗管底的pellet×2遍； 7、加入U(xiǎn)rea-Lysis buffer 10-15ul裂解pellets，vortex10min； 8、4℃遇冷離心：13000rpm×10min；用BUFFER A 90ul稀釋，此為核基質(zhì)蛋白。 植物組織蛋白質(zhì)提取方法 1、根據(jù)樣品重量（1g樣品加入3.5ml提取液，可根據(jù)材料不同適當(dāng)加入），準(zhǔn)備提取液放在冰上； 2、把樣品放在研缽中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上靜置（3-4小時(shí)）； 3、用離心機(jī)離心8000rpm40min4℃或11000rpm20min4℃； 4、提取上清液，樣品制備完成； 蛋白質(zhì)提取液：300ml 1、1Mtris-HCI（PH8）45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮6g 這種方法針對(duì)SDS-PAGE，垂直板電泳！ 組織：腸黏膜為例 應(yīng)用TRIPURE提取蛋白質(zhì)步驟： 含蛋白質(zhì)上清液中加入異丙醇（1.5ml/1mlTRIPURE用量） 倒轉(zhuǎn)混勻，置室溫10min 離心：12000g，10min，4度，棄上清 加入0.3M鹽酸胍/95%乙醇：（2ml/1mlTRIPURE用量） 振蕩，置室溫20min 離心：7500g，5min，4度，棄上清 重復(fù)0.3M鹽酸胍/95%乙醇步2次 沉淀中加入100%乙醇2ml 充分振蕩混勻，置室溫20min 離心：7500g，5min，4度，棄上清吹干沉淀 1%SDS溶解沉淀 離心：10000g，10min，4度 取上清-20度保存（或可直接用于WESTERN BLOT） 存在的問題：加入1%SDS后沉淀不溶解，還是很大的一塊，4度離心后又多了 白色沉淀，SDS結(jié)晶？測濃度，含量才1mg/1ml左右 解決：提蛋白試劑盒，另外組織大小適中，要碎，立即加2×BUFFER，然后煮5-10分鐘，效果很好的。 |
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