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小柴不拆
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科研干貨|13種蛋白提取方法，趕快收藏手慢無(wú)！（二）
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Loading Buffer煮細(xì)胞抽提總蛋白 1、細(xì)胞計(jì)數(shù)（約1×10^6的細(xì)胞），離心收集細(xì)胞（2000rpm×5min）； 2、預(yù)冷1×PBS500ul重懸洗一次，轉(zhuǎn)至500ulEP管（2000rpm×5min）； 3、 去上清，后甩一次，將上清去盡； 4、按每1×10^6的細(xì)胞加50ul loading buffer 加入2×loading； 5、Vortex一下，煮10~15min一次×2~3次直至無(wú)粘絲； 6、每次煮好將其放于冰上，靜置約2min，Vortex一下，再甩一下； 7、三次后用槍吸氣，沒(méi)有粘絲后，即可； 8、每次上樣約5ul（50ug/ul蛋白） RIPA裂解抽提總蛋白 1、細(xì)胞計(jì)數(shù)（約1×10^7的細(xì)胞），離心收集細(xì)胞（2000rpm×5min）； 2、預(yù)冷1×PBS1mll重懸洗2次，轉(zhuǎn)至1.5mlEP管（2000rpm×5min）； 3、 去上清，后甩一次，將上清去盡； 4、按照如下比例加入裂解試劑： RIPA：300ul/1×10^7細(xì)胞 PMSF：3ul（1:100） Cocktail：0.3ul（1:1000） 5、吹打均勻、冰上冷置30-40min，中間每10分鐘Vortex一下； 6、4℃預(yù)冷離心：10000rpm×10min； 7、收集上清，轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷新EP 管，即為總蛋白。 核漿蛋白抽提 一.收核-漿蛋白 收漿蛋白 1、細(xì)胞計(jì)數(shù)（約1.5×10^7的細(xì)胞），離心收集細(xì)胞（1100rpm×5min）； 2、用4℃預(yù)冷的PBS重懸，轉(zhuǎn)至1.5mlEP管中，離心（4000rpm×5min,4℃）； 3、去上清，加入A Buffer1mL/1×10^7cell，重懸，4℃放置10min，離心（2500rpm×3min,4℃）； 4、去上清，加入A’Buffer 250ul/1.5×10^7cell，重懸，4℃放置3min，離心（5000rpm×1min,4℃），吸取上清（上清是漿蛋白） 收核蛋白 5、再用A’Buffer 500ul/1.5×10^7cell，重懸，4℃放置3min，離心（5000rpm×1min,4℃），吸走上清，12000rpm×30sec，把上清完全吸干凈； 6、剩余沉淀中加入B’Buffer（或者RAP）50ul，重懸（振蕩），4℃放置40min（每隔10min振蕩一次）； 7、離心（12000×10min,4℃），取上清即為核蛋白，-80℃保存。 |
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