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一芯向南新蟲(chóng) (小有名氣)
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[交流]
高純度RNA的提取方法及操作中的注意事項(xiàng) 已有1人參與
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RNA提取 在分子生物學(xué)研究中，多數(shù)實(shí)驗(yàn)需要獲得目的基因的序列進(jìn)而確定基因的表達(dá)水平，這就需要得到樣品中高質(zhì)量、高純度的RNA，本文就RNA提取的原理、方法和注意事項(xiàng)進(jìn)行總結(jié)，并提供了不同類型樣品RNA提取的推薦試劑盒。 RNA研究的重要性 DNA，RNA和蛋白質(zhì)是三種重要的生物大分子。DNA的遺傳信息決定生命的主要性狀，而mRNA在信息傳遞中起很重要的作用。其它兩大類RNA，rRNA和tRNA，同樣在蛋白質(zhì)的生物合成中發(fā)揮不可替代的重要功能。因此RNA在遺傳信息由DNA傳遞到表現(xiàn)生命性狀的蛋白質(zhì)的過(guò)程中舉足輕重。 RNA提取方法 最常用的RNA提取方法是Trizol法。Trizol試劑直接從細(xì)胞或者組織中提取總RNA，該試劑含異硫氰酸胍能迅速破碎細(xì)胞，并保持RNA的完整性。加入氯仿后離心，樣品分水樣層和有機(jī)層，RNA位于水樣層中，收集水樣層，通過(guò)異丙醇沉淀將其還原，可得到純凈RNA。 RNA提取步驟 細(xì)胞或組織裂解 1) 細(xì)胞裂解 a) 貼壁細(xì)胞裂解。6 孔板培養(yǎng)細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，預(yù)冷的 PBS 洗滌一次，每孔加入 1 mL RNA提取試劑（TRIZOL 型），吹打混勻，轉(zhuǎn)移到 1.5 mL EP 管中，室溫靜置 5 min。 b) 懸浮細(xì)胞裂解。離心收集懸浮細(xì)胞，按照 5-10×106 個(gè)細(xì)胞需要 1 mL RNA 提取試劑（TRIZOL）的比例加入試劑，混勻，室溫靜置 5 min。 2)組織裂解。稱取 10-50 mg 組織（新鮮或-70℃或液氮中保存的均可），置于1.5 mL EP 管中，加入 1 mL RNA 提取試劑（TRIZOL 型），利用手持式電動(dòng)勻漿儀進(jìn)行勻漿處理，室溫靜置 5 min。 加入200 μL 氯仿，劇烈震蕩（Vortex）15s。 12,000 ×g，4 ℃，離心 10 min，樣品分為三層，RNA 集中在上層的無(wú)色水相中，DNA 集中在中間層，而蛋白集中在下層的淡紫紅色液相中。 轉(zhuǎn)移上層水相至新的 EP 管，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻 10-20 次。 12,000×g，4 ℃離心 10 min，可以在管底或管壁上看到白色凝膠狀的 RNA 沉淀，棄上清液。 加入 1 mL 75%的乙醇，輕微震蕩 15 sec，洗滌 RNA 沉淀。 12,000×g，4 ℃離心 5 min，RNA 沉淀到管底，棄上清。 瞬時(shí)高速離心，使管壁上的液體離心到管底，利用微量移液器吸盡液體，晾干。 加入 100-200 μL RNA 溶解液或 RNase-free ddH2O，溶解 RNA。 測(cè)定 RNA 濃度與純度，用于反轉(zhuǎn)錄或其它實(shí)驗(yàn)，或保存于-80℃冰箱。 RNA提取注意事項(xiàng) 所有實(shí)驗(yàn)所用的槍頭、離心管等消耗品均要使用RNase-free的； 整個(gè)過(guò)程要在無(wú)RNase污染的條件下進(jìn)行，通常可以在無(wú)菌操作臺(tái)中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并用75%的酒精進(jìn)行擦拭殺菌； 所有相關(guān)溶液的配制要使用RNase-free水或DEPC水 (包括75%酒精也需要用無(wú)水乙醇與DEPC水配制)； 溶液的配制使用移液器進(jìn)行操作，切勿使用量筒等中間器皿； 研缽、研棒、鑷子、剪刀等用錫箔紙包好后，200℃干熱滅菌4h； 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中一定要戴手套和口罩（可以避免實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不打噴嚏）； 異丙醇、氯仿、乙醇等試劑使用避免多次使用的交叉污染； |
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2樓2023-01-01 10:30:53
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