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長(zhǎng)夏123新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
體外肝微粒體代謝問(wèn)題
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 我進(jìn)行體外肝微粒體孵育實(shí)驗(yàn)，加入相應(yīng)底物 代謝后體系中一直檢測(cè)不到代謝產(chǎn)物，我該怎么辦，與沒(méi)有做過(guò)的前輩指導(dǎo)一下 我的體系是這樣配制的 0.1MTris-Hcl緩沖液 ：稱(chēng)取Tris3.03g加入150ml新沸冷水溶解，加濃HCL調(diào)PH至7.4,新沸冷水定容到250ml搖勻 1%的NaHCO3溶液：精密稱(chēng)取NaHCO3100mg，置于10ml容量瓶，加水溶解并稀釋至刻度定容 0.15M MgCl2 溶液的制備：取2.86gMgcl2,加水溶解定容至200ml 啟動(dòng)子溶液(0.5ML體系)：稱(chēng)取NADP 10Mg，NADPH 5Mg置于同一EP管，加入0.5ml 1%的NaHCO3分裝.放到－20保存，使用時(shí)放到冰上融化。 配制過(guò)程冰浴。 NADPH再生系統(tǒng)溶液（10ml體系）：一水檸檬酸28.55mg，異檸檬酸脫氫酶1.38ml，于小燒杯加0.15M Mgcl2溶液 0.95ml, 0.1M Tris-HCL 溶液9.05ml溶解。配制過(guò)程冰浴。完成后每1ml分裝于1.5mlEP管中，約10管。置于-20°冰箱保存。用時(shí)解凍后使用。因?yàn)橘?gòu)買(mǎi)不到枸櫞酸脫氫酶所以用異檸檬酸脫氫酶進(jìn)行代替,體系不反應(yīng)是這里出現(xiàn)問(wèn)題了嗎？ 終止液：3mg氯雷他定溶于1ml乙腈 ，取100ul加入9.9ml乙腈。得30ng/ml得氯雷他定乙腈溶液10ML。每1ml分裝于1.5EP管分10管。 －２０°Ｃ 儲(chǔ) 存 1.5EP管中加NADPH再生系統(tǒng)189μL，人肝微粒體5μL（人微粒體蛋白終濃度0.5 mg/ml），加入1A2探針底物10000μM非那西汀溶液1μL，渦旋混勻1min。經(jīng)37℃水浴 預(yù)孵育5 min后，加入啟動(dòng)子溶液5μL啟動(dòng)反應(yīng)渦旋混勻1min，繼續(xù)水浴 孵育20min。加入冰冷的乙腈400μL（含內(nèi)標(biāo)氯雷他定）終止反應(yīng)。渦旋振蕩3min， 13000rpm離心15min沉淀蛋白，取上清液后液相測(cè)定，底物減少的量,代謝產(chǎn)物生成量。平行做三組. 有人指導(dǎo)一下嗎，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室就我自己也沒(méi)有任何人指導(dǎo)都是自己摸索，也不知道哪里不對(duì)，求前輩們指導(dǎo)一下 |
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