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[交流]
常用蛋白表達系統(tǒng)
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引言 通常，難以從天然來源直接獲得高質(zhì)量的特定蛋白，尤其是人體蛋白。很多研究者通過將基因克隆至可在易培養(yǎng)細(xì)胞中操作的人工載體上，通過異源表達來克服這個問題，這些細(xì)胞包括大腸桿菌、畢赤（酵母）及一系列的昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞。 大腸桿菌表達系統(tǒng) 是應(yīng)用最廣泛的蛋白表達系統(tǒng)之一，市面上的重組蛋白有30%是由大腸桿菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)而來，是小分子細(xì)胞質(zhì)蛋白或結(jié)構(gòu)域表達的首選宿主。在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達的外源基因包括原核基因和真核基因；原核基因可以直接在大腸桿菌中表達出來，真核基因含有內(nèi)含子，大腸桿菌不能對mRNA進行剪切形成成熟的mRNA，因此，真核基因一般以cDNA構(gòu)建表達載體在大腸桿菌系統(tǒng)中表達。 優(yōu)勢： 表達背景清楚、表達水平高、宿主菌繁殖快、培養(yǎng)簡單、價格便宜、標(biāo)簽多 樣、蛋白表達量大。 劣勢： 沒有真核生物的翻譯后修飾、大蛋白可能不能正常折疊、一些蛋白可能對宿主有毒性、包涵體復(fù)性難。 質(zhì)粒：Pet系列、pGEx系列、MBP（麥芽糖系統(tǒng)） 菌株：BL21、Rosetta等 標(biāo)簽：His、GST、MBP、SUMO、FLAG、GFP、HA等 主要應(yīng)用：制備抗原、蛋白酶活性檢測、蛋白互作（Co-IP、Pull-down等）、蛋白晶體研究、生化實驗等。 酵母系統(tǒng) 自1979年，為了克服大腸桿菌表達系統(tǒng)的缺點，延伸了酵母表達系統(tǒng)。酵母表達系統(tǒng)兼有原核和高等真核系統(tǒng)的優(yōu)點。與其他表達系統(tǒng)的基因存在于游離質(zhì)粒上不同，它的表達質(zhì)粒是通過同源重組整合在基因組上的，轉(zhuǎn)化簡單（不需要病毒原液），表達菌株可以長時間保持（大于10年）而不失活。 優(yōu)勢： 使用簡單、表達量高、可大規(guī)模生產(chǎn)、相對低廉的價格、有很多真核的翻譯后修飾和加工、大蛋白能較好地折疊。 劣勢： 培養(yǎng)時間相較于細(xì)菌較長、標(biāo)簽較少、不能進行復(fù)雜的翻譯后修飾。 質(zhì)粒：pPIC3K、pPICZA、pPIC3.5K 菌株：X33、GS115 主要應(yīng)用：適合于穩(wěn)定表達有功能的外源蛋白質(zhì)，而且可大規(guī)模發(fā)酵，是理想的重組真核蛋白生產(chǎn)制備工具。 昆蟲系統(tǒng) 屬于真核細(xì)胞表達系統(tǒng)，但不同于酵母和哺乳動物細(xì)胞表達系統(tǒng)。通過轉(zhuǎn)座作用將轉(zhuǎn)移載體中的表達組件定點轉(zhuǎn)座到能在大腸桿菌中繁殖的桿狀病毒穿梭載體上，通過抗性和藍白斑篩選到重組穿梭質(zhì)粒，提取穿梭質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞后，得到的子代病毒即為重組病毒。將病毒上清浸染昆蟲細(xì)胞，獲得表達的重組蛋白。 優(yōu)勢： 大蛋白正確折疊、具有真核翻譯后修飾、毒性蛋白可被表達。 劣勢： 費用較高、重組桿狀病毒費時較長、需組織培養(yǎng)條件。 載體：pFastBAC 菌株：sf9、sf21、High-5等 主要應(yīng)用：用于生產(chǎn)具有哺乳動物細(xì)胞末端唾液酸化修飾的N糖蛋白。 表達系統(tǒng)的選擇 選擇表達系統(tǒng)主要考慮蛋白質(zhì)的大小、需要蛋白質(zhì)的量、蛋白質(zhì)來源的物種，以及蛋白質(zhì)是否有二硫鍵和翻譯后修飾。如果只需要少量目標(biāo)蛋白——如當(dāng)篩選一系列點突變用于酶活性研究時，不需要優(yōu)化生產(chǎn)條件。但是，如果必須純化一個活性蛋白和/或需要大量蛋白質(zhì)時，在發(fā)現(xiàn)一個大規(guī)模可用方法前就需要嘗試不同的宿主-載體系統(tǒng)、表達條件和/或純化方案。 展望 隨著藥物審批上市相關(guān)激勵政策不斷完善和落實，加上數(shù)字化技術(shù)在中國的迅速發(fā)展，中國生物醫(yī)藥領(lǐng)域技術(shù)逐漸與世界接軌，國內(nèi)外醫(yī)藥企業(yè)一致看好中國生物醫(yī)藥市場，紛紛開始擴大生物醫(yī)藥市場的部署與投資。重組蛋白表達系統(tǒng)將會隨著生物技術(shù)的發(fā)展越來越成熟和多元化。 |
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5樓2022-03-02 08:27:18
簡單回復(fù)
nono20093樓
2022-02-09 12:34
回復(fù)
Abby7171(金幣+1): 謝謝參與
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