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[求助]
請(qǐng)教2-oxoglutarate-dependent dioxygenases體外酶活檢測(cè)注意事項(xiàng) 已有2人參與
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| 最近在做一個(gè)2-oxoglutarate-dependent dioxygenases的體外酶活活性一直做不出來(lái)，于是找了一個(gè)文章報(bào)道的已知功能的酶去做體外酶活，蛋白純化沒(méi)問(wèn)題，體外酶活條件也是按照文獻(xiàn)報(bào)道做的，可是也做不出來(lái)，求助大神這個(gè)反應(yīng)有沒(méi)有什么需要注意的細(xì)節(jié)沒(méi)。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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酶的活性及其檢測(cè)（一）-穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué) 近代生命科學(xué)的研究的興起，和酶的研究的發(fā)展是同步的。生物，哪怕是最簡(jiǎn)單的生物都含有眾多的高分子物質(zhì)如核酸，多糖，蛋白，脂類(lèi)等等。如果沒(méi)有純度很高的酶，是無(wú)法展開(kāi)更多研究的。沒(méi)有酶的作用理論突破，也是無(wú)法進(jìn)行酶的定量研究。第一個(gè)發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶的Arthur Kornberg在核酸復(fù)制酶學(xué)十誡里面有兩條：（1）不要為不純的酶或（2）不純的底物而浪費(fèi)精力[1]。 酶作用的基本要素包括純的酶，純的底物，將兩者混合后，可以觀(guān)察底物的消耗，或者看產(chǎn)物的生成，如果檢測(cè)手段足夠，可以看中間態(tài)的生成與消耗。下面一個(gè)曲線(xiàn)，在學(xué)習(xí)初期，讓我困惑了很久。 這張圖中，在前面10（分鐘）內(nèi)，產(chǎn)物的增加呈線(xiàn)性，10-25（分鐘）之間產(chǎn)物增加，但是增加速度變慢，在25分鐘后，產(chǎn)物不再增加。我在一些文獻(xiàn)中，會(huì)看到類(lèi)似的圖出現(xiàn)。它反應(yīng)出的信息是產(chǎn)物增加，隨時(shí)間變化增加變緩最終達(dá)到平臺(tái)期。解釋起來(lái)的原因會(huì)有多種，（1）隨著底物消耗，酶沒(méi)有足夠的底物，最后酶催化反應(yīng)停滯，（2）酶不穩(wěn)定，在反應(yīng)過(guò)程中逐漸失活，（3）產(chǎn)物對(duì)酶有抑制作用，還有其它可能的解釋。 讓人困擾的是，有時(shí)候圖一和米氏曲線(xiàn)（圖二）太像了。下面的圖中，在一定底物濃度范圍內(nèi)[如10（微摩爾）]，反應(yīng)速率隨著底物濃度增加而線(xiàn)性增加。在10-25（微摩爾）之間，隨著底物濃度增加，速率增加趨緩。在25微摩爾之后，反應(yīng)速率不再隨著底物濃度增加而變化將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用方程 y=A×x÷(B+x) （其中A，B為常數(shù)，y為反應(yīng)速率，x是底物濃度） 來(lái)擬合，以下為底物的三種特例： （1）當(dāng)?shù)孜餄舛群艿蜁r(shí) y=lim┬(x→0)〖[A×x÷(B+x)]〗 方程退化為： y =(A/B)×x 此時(shí)反應(yīng)底物濃度低，反應(yīng)速率與底物濃度呈正比 （2）當(dāng)?shù)孜餄舛茸銐蚋邥r(shí) y=lim┬(x→∞)〖[A×x÷(B+x)]〗 方程退化為 y = A (A稱(chēng)為Vmax) 此時(shí)反應(yīng)底物濃度高，反應(yīng)速率為常數(shù)，與底物濃度無(wú)關(guān) （3）當(dāng)y = A/2 方程為 A/2=A×x÷(B+x) 得到 x = B （B稱(chēng)為Km） 利用Igor Plot，擬合米氏方程給出的值是。注：后面給出的不是實(shí)驗(yàn)誤差值，而是擬合誤差。 A =158.25 ± 8.79 （單位） B =10.015 ± 1.73 （單位） A的生化意義是在反應(yīng)體系中，一定酶濃度能達(dá)到的最大反應(yīng)速率，而B(niǎo)的含義則是酶達(dá)到最大反應(yīng)速率的一半時(shí)，對(duì)應(yīng)的底物濃度。 這就是生化課本中的米氏方程。在實(shí)驗(yàn)中，底物濃度足夠高和足夠低是相對(duì)B而言，數(shù)學(xué)意義上的極高和極低在實(shí)驗(yàn)中可操作性不強(qiáng)。 在一個(gè)酶催化反應(yīng)體系中，酶的濃度是固定的，酶與底物結(jié)合是酶催化底物的前提，如以下平衡： 酶+底物↔酶*底物復(fù)合物 而酶催反應(yīng)的發(fā)生最簡(jiǎn)機(jī)理如下： 酶+底物↔酶*底物復(fù)合物→酶+產(chǎn)物 ① ② 在反應(yīng)步驟①及②中，在底物濃度較低情況下，①是限速反應(yīng)，根據(jù)質(zhì)量作用定律，在一定濃度范圍內(nèi)，酶*底物復(fù)合物的形成速率與底物的增加成正比，所以此階段，反應(yīng)速率和底物增加呈線(xiàn)性關(guān)系。而底物增加到一定濃度后，此時(shí)，幾乎所有的酶都以酶*底物復(fù)合物的形式存在，②變成了限速反應(yīng)，反應(yīng)速度和底物濃度沒(méi)有關(guān)系。在反應(yīng)①時(shí)，底物在溶液中移動(dòng)速率時(shí)自由擴(kuò)散，此步反應(yīng)為可逆，反應(yīng)②為不可逆反應(yīng)（或逆反應(yīng)速率很�。�。 我的老師曾說(shuō)過(guò)做酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)是生物實(shí)驗(yàn)中最容易產(chǎn)生數(shù)據(jù)的，幾組實(shí)驗(yàn)下來(lái)，總能找到數(shù)據(jù)來(lái)計(jì)算A（Vmax）和B（Km）。但我當(dāng)初做酶活實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)幾個(gè)問(wèn)題，（1）底物濃度低時(shí)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)變動(dòng)較大，（2）Vmax重復(fù)性較好，Km重復(fù)性較差。為了得到重復(fù)性好的，可靠性高的數(shù)據(jù)，個(gè)人經(jīng)驗(yàn)如下： （1）選擇合理的反應(yīng)酶濃度，太高，測(cè)低底物濃度反應(yīng)速度數(shù)據(jù)波動(dòng)大；太低，反應(yīng)很容易飽和，Km值偏差特別大 （2）合理篩選反應(yīng)底物濃度區(qū)間及離散距離，建議在Km值兩旁平衡分步，在左側(cè)間距相近，右側(cè)間距可以拉開(kāi) （3）控制反應(yīng)溫度，有條件的話(huà)，讓反應(yīng)溫度恒定，攪拌均勻，確信酶在反應(yīng)監(jiān)測(cè)時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定 （4）如果不同時(shí)間內(nèi)的數(shù)據(jù)相互比較，用同一批次的酶（可低溫分裝），用同一批次的底物（最好標(biāo)定底物濃度），同批配置的反應(yīng)buffer，同樣的反應(yīng)器皿（如石英杯），同樣的檢測(cè)器等。 先說(shuō)一下這兩張圖的聯(lián)系，在圖一中，是底物濃度和時(shí)間的關(guān)系，所以曲線(xiàn)每個(gè)點(diǎn)的切線(xiàn)斜率就是反應(yīng)速度（濃度/時(shí)間）。以每個(gè)底物濃度，做一個(gè)底物濃度和時(shí)間的實(shí)驗(yàn)，取其初期的直線(xiàn)部分，計(jì)算得到該底物濃度下的反應(yīng)速率，就得到下圖的一個(gè)點(diǎn)。對(duì)不同底物（如9個(gè)）濃度做圖一曲線(xiàn)，計(jì)算得到9個(gè)速率，然后作圖二，就完成了米氏實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)重復(fù)原則，一般每個(gè)點(diǎn)要重復(fù)3次，所以為了得到圖二，要做27個(gè)圖一的實(shí)驗(yàn)（稱(chēng)之為re-plot）。 酶和底物需要結(jié)合后才能進(jìn)行催化反應(yīng)的概念首先被物理化學(xué)家Victor Henri在1901年研究糖水解酶時(shí)發(fā)現(xiàn)，他第一次給出了反應(yīng)速率與底物和產(chǎn)物濃度的方程式。Henri是酶動(dòng)力學(xué)的先驅(qū)，米氏動(dòng)力學(xué)也被稱(chēng)為Henri-Michaelis-Menten kinetics。他的研究啟發(fā)了德國(guó)生物化學(xué)家Leonor Michaelis以及加拿大物理學(xué)家Maud Menten，他們給出了更簡(jiǎn)潔的表達(dá)式，而且明確的提出了反應(yīng)機(jī)理。 值得注意的是，米氏方程應(yīng)用于描述的是平均化的結(jié)果，其中酶反應(yīng)過(guò)程的中間步驟的信息被平均掉了，如何得到反應(yīng)過(guò)程中的信息，下一篇將會(huì)闡述。 原創(chuàng),圖片無(wú)法貼上去，轉(zhuǎn)請(qǐng)@pennchem |
7樓2022-03-15 21:03:24
pennchem
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