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NanoFCMlxq新蟲 (正式寫手)
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[交流]
外泌體相關研究文獻分享,輕松讀完一篇文獻（十四） 已有2人參與
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今天分享一篇發(fā)表在Advanced Science（2021年IF=16.806）上的文章，名為《Embryonic Stem Cells-Derived Exosomes Endowed with Targeting Properties as Chemotherapeutics Delivery Vehicles for Glioblastoma Therapy》[1]（胚胎干細胞來源的外泌體具有靶向特性，可作為膠質(zhì)母細胞瘤治療的化療藥物遞送載體）。 膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，死亡率和致殘率均較高。除了耐藥性很高，其不良預后的另一個關鍵原因是血腦屏障(BBB)限制了化療藥物到達腫瘤區(qū)域。因此，專門開發(fā)設計藥物傳遞策略來克服血腦屏障是實現(xiàn)GBM有效治療的迫切需求。 在以前的研究中，人們已經(jīng)努力開發(fā)合成藥物傳遞系統(tǒng)來透過生物屏障。然而，這些合成的納米載體仍存在生物毒性和血腦屏障穿透能力低下等問題。外泌體是一類雙層脂質(zhì)細胞外囊泡，可由幾乎所有類型的哺乳動物細胞分泌，粒徑分布為30-100nm，通過將分子從親本細胞運輸?shù)绞荏w細胞來響應細胞間的通信。在天然衍生的納米載體種，外泌體由于其低生物毒性和多種的生物功能，如免疫特性、裝載物保護和最重要的生物屏障穿透能力，被認為是優(yōu)秀的藥物傳遞納米載體。據(jù)報道，外泌體由于其特殊的表面結(jié)構(gòu)，如四酯酶蛋白和整合素，而表現(xiàn)出內(nèi)在的組織或細胞靶向特性。此外，通過工程表面分子可以獲得更好的外泌體靶標能力。盡管基于外泌體的藥物載體取得了進展，但還應該確定一種適合外泌體衍生的細胞類型。 人胚胎干細胞(ESCs)是一種來自囊胚內(nèi)細胞團的多能干細胞，可以在體外培養(yǎng)中幾乎無限期保持未分化。此外，它們也具有無限增殖的能力。因此，ESCs可以大規(guī)模產(chǎn)生具有穩(wěn)定特性的外泌體(ESC-exos)，這是外泌體臨床應用的重要因素。此外，ESC微環(huán)境已被證實可以抑制癌細胞的致癌表型。研究表明，惡性癌細胞在胚胎微環(huán)境中被重新編程為分化程度更高、侵襲性更低的表型。ESC-exos含有反映胚胎微環(huán)境含量的物質(zhì)，這可能是ESCs介導的抗腫瘤作用的主要效應因素。此外，有研究發(fā)現(xiàn)ESC-exos可以將人類乳腺癌細胞重新編程為一個較低惡性的細胞表型。因此，與其他類型的細胞相比，ESCs是非常適合量產(chǎn)外泌體，可以在癌癥治療中開發(fā)基于外泌體的化療載體。 然而，盡管外泌體顯示出穿透血腦屏障的能力，但許多研究表明，靜脈注射的外泌體主要分布在肝臟或脾臟，并且極小部分注射的外泌體保留在大腦或腫瘤部位。因此，在使用ESC-exos治療膠質(zhì)瘤之前，應該采取有效的策略來解決這個問題。用腫瘤靶向配體直接修飾外泌體表面已被證明可以有效增強外泌體的腫瘤滯留。Cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys)肽(c(RGDyK))是一種著名的癌癥化療靶向配體，與αvβ3整合素受體具有高親和力，αvβ3整合素受體在GBM、前列腺癌和肺癌等腫瘤組織積極增殖的內(nèi)皮表面過表達。這些研究表明，用c(RGDyK)修飾的納米載體可以更有效地將化療藥物傳遞到癌細胞中，并能顯著提高抗腫瘤效果。此外，用c(RGDyK)修飾的外泌體具有較強的穿過血腦屏障的能力。然而，用c(RGDyK)修飾的ESC-exos是否能增強ESC-exos在膠質(zhì)瘤部位的分布，并提高膠質(zhì)瘤的治療效率，目前尚不清楚。 基于上述陳述，本研究開發(fā)了一種通過c(RGDyk)肽修飾ESC-exos的腫瘤靶向腫瘤(cRGD-ESC-exos)傳遞系統(tǒng)，用于膠質(zhì)瘤治療，希望通過結(jié)合ESC-exos的先進特性和靶向配體，可以開發(fā)出一種有效的基于外泌體的策略，用于膠質(zhì)瘤的治療，我們的工作也可以促進ESC-exos在藥物傳遞中的應用。 研究過程： 一、ESCs和ESC-Exos的表征 在Matrigel上培養(yǎng)的ESCs形成了一個緊密的尖銳邊緣菌落(圖1a)。免疫染色分析顯示，細胞球中所有細胞均表達堿性磷酸酶(ALP，圖1b)和多能性標記分子，包括Nanog、Oct4、SSEA4、TRA1-60和TRA1-81(圖1c)。培養(yǎng)細胞的這些特征與ESCs的特征相一致。之后，從細胞培養(yǎng)上清中純化ESC-exos，并通過透射電子顯微鏡(TEM)、免疫印跡和納米流式分析儀(NanoFCM)進行表征。透射電鏡圖像清楚地顯示，ESC-exos呈圓形形態(tài)，直徑約為75nm(圖1d)。Western blot證實ESC-exos表達外泌體特異性標記物CD63、Alix和TSG101，不表達陰性標記物高爾基膜結(jié)合蛋白GM130(圖1e)。納米流式分析顯示，平均直徑為70.2±18nm(圖1f)，ESC-exos的濃度約為1×10^11顆粒/mL。這些數(shù)據(jù)表明，我們已經(jīng)成功地從ESCs培養(yǎng)基中提取和純化了ESC-exos。 二、ESC-Exos在體外和體內(nèi)均顯示GBM抑制活性 為了確認ESC-exos是否具有廣泛的抗癌活性，特別是對GBM，我們培養(yǎng)了6種癌細胞系，包括人GBM細胞系(U87和U251)、肺癌細胞系(A549)、肝細胞癌(HCC)細胞系(HepG2)、黑色素瘤細胞系(B16)、乳腺癌細胞系(MDA-MB-MB-231)和前列腺癌細胞系(DU145)，在含ESC-exos(1×10^9顆粒/mL)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h。如圖2a和圖S1所示，細胞活力試驗(CCK-8試驗)顯示，ESC-exos顯著降低了這些癌細胞的活力。為了進一步證實ESC-exos在GBM細胞中的作用，我們使用U87和U251細胞系進行了后續(xù)實驗。 為了對U87和U251細胞發(fā)揮作用，ESC-exos需要被這些細胞吸收。因此，ESC-exos用親脂性熒光染料DiI標記，加入U87和U251細胞培養(yǎng)基中。孵育12h后，ESC-exos被U87和U251有效內(nèi)化(圖2b)。為評價細胞凋亡的影響，采用AnnexinV-PE/7-AAD標記進行流式細胞術檢測ESC-exos(1×10^9顆粒/mL)處理后細胞凋亡的誘導作用。與對照組相比，ESC-exos組的凋亡細胞百分比顯著增加(圖2c，d)。這些數(shù)據(jù)表明，ESC-exos通過抑制細胞活力和促進細胞凋亡影響GBM細胞生長。 為了評估ESC-exos是否能夠影響體內(nèi)GBM的生長，我們進行了攜帶皮下U87GBM異種移植的無胸腺裸鼠實驗。一旦腫瘤腫塊生長到約200mm3（≈2周），小鼠每隔一天靜脈注射磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，對照組，Ctl，125?L)或ESC-exos(125?L，1×10^11顆粒/mL)，持續(xù)2周。從這些小鼠中切除的腫瘤如圖2e所示，腫瘤生長曲線和腫瘤重量如圖2f、g所示。在研究結(jié)束時，注射ESC-exos的小鼠的腫瘤大小(401.3±122.3mm3)明顯小于注射PBS的小鼠(872.4±128.2mm3；p<0.01)。與PBS治療組相比，ESC-exos治療組的腫瘤體重也顯著下降(1.0±0.1g VS 0.6±0.2g；p<0.05)。這些數(shù)據(jù)表明，與PBS組相比，ESC-exos組的腫瘤生長明顯受到抑制。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明ESC-exos在體內(nèi)表現(xiàn)出抗GBM的作用。 既往研究證實了ESCs微環(huán)境的抑瘤作用。ESCs微環(huán)境可以通過降低克隆原性和致瘤性，將侵襲性癌細胞重新編程為良性表型。Nodal信號通路已被證明參與了這一過程。ESC-exos含有反映其來源細胞內(nèi)容的物質(zhì)，據(jù)報道可將乳腺癌細胞重新編程到良性階段，并降低其致瘤性。ESC-exos對惡性癌細胞重新編程的機制與將其內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到靶癌細胞有關。本研究應用體外和體內(nèi)模型證明了ESC-exos的抗GBM特性。然而，這一現(xiàn)象背后的機制在本研究中并不是模糊的。根據(jù)先前的研究，可能的潛在機制可能是ESC-exos包含ESC特異性的重編程因子，這些因子可以被傳遞到靶向GBM細胞，隨后將其恢復為良性表型。 三、cRGD-Exo-PTX的制備 許多藥物跨越血腦屏障的能力較差，這極大地限制了化療對GBM的療效。外泌體具有跨越血腦屏障的內(nèi)在能力，因此，適合克服與因其血腦屏障不通透性而無法進入臨床試驗的潛在藥物相關的問題。ESCs可以為臨床應用提供豐富的外泌體來源，ESC-Exos具有證明的顯著的抗GBM作用。這些特性使ESC-exos成為一個很有前途的用于GBM治療的藥物傳遞載體的工具。然而，靜脈注射后未經(jīng)修飾的外泌體的生物分布研究顯示，外泌體在肝臟和脾臟器官中快速積累，很少有外泌體被傳遞到大腦。因此，ESC-exos的靶向特性需要改進，才能用于提供針對GBM的治療。已經(jīng)有充分的研究表明，c(RGDyK)肽結(jié)合藥物傳遞系統(tǒng)用于活性腫瘤靶向治療。紫杉醇(PTX)是一種抑制腫瘤細胞的有絲分裂抑制劑，廣泛用于實體腫瘤的治療。雖然PTX顯示出有效的抗GBM活性，但由于其低血腦屏障通透性低，不能在體內(nèi)產(chǎn)生治療效果。 為了獲得適合于后續(xù)實驗的工程ESC-exos，首先將ESC-exos與c(RGDyK)偶聯(lián)，然后通過共孵育加載PTX，命名為cRGD-Exo-PTX(圖3a)。通過透射電鏡檢測Exo-PTX(裝載PTX的ESC-exos)和cRGD-Exo-PTX的形態(tài)，均顯示為圓形的球形囊泡(圖3b)。采用NanoFCM分析了粒徑的分布范圍。Exo-PTX和cRGD-Exo-PTX的平均直徑分別為107±20和125.2±27nm(圖3c)。這些結(jié)果表明，cRGD-Exo-PTX和Exo-PTX在cRGD修飾和載藥后保持了完整性。 四、cRGD-Exo-PTX在體外和體內(nèi)的靶向能力 在制備cRGD-Exo-PTX后，我們評估了cRGD-Exo-PTX的靶向能力。用DiI標記的Exo-PTX和cRGD-Exo-PTX孵育U87和U251細胞，然后在熒光顯微鏡下觀察熒光信號。Exo-PTX和cRGD-Exo-PTX的濃度均為1×10^9個顆粒/mL。cRGD-Exo-PTX孵育的U87和U251細胞比Exo-PTX孵育的細胞信號更強(圖4a)，這表明cRGD-Exo-PTX在體外具有顯著的GBM細胞靶向能力。此外，我們通過原位異種移植物證實了cRGD-Exo-PTX在體內(nèi)的積累能力。Exo-PTX和cRGD-Exo-PTX分別用DiR標記。然后，在原位植入1周后，將125?L DiR標記的Exo-PTX或cRGD-Exo-PTX(1×10^11顆粒/mL)靜脈注射到荷瘤小鼠體內(nèi)(n=3)。通過實時成像系統(tǒng)記錄了在24和48h時的熒光信號強度。如圖4b所示，cRGD-Exo-PTX處理組腫瘤區(qū)域的熒光強度明顯高于exo-PTX處理組。然后收集主要器官（腦、肝、脾、肺、腎、腸），并進一步檢測這些器官中的熒光信號。如圖4c所示，Exo-PTX組的大腦熒光強度弱于cRGD-Exo-PTX組。相反，exo-PTX處理的小鼠的其他器官（肝、脾、肺、腎和腸）的熒光明顯強于cRGD-Exo-PTX處理的小鼠。這些結(jié)果表明，cRGD-Exo-PTX比Exo-PTX更有效地在膠質(zhì)瘤部位積累，證明了cRGD-Exo-PTX的腫瘤靶向能力。 五、cRGD-Exo-PTX的體外靶向治療 在驗證了cRGD-Exo-PTX的靶向能力后，我們通過Cck8和Click-iTEdU實驗檢測了cRGD-Exo-PTX對U87和U251細胞的抗增殖作用。U87和U251細胞與PBS(對照組，Ctl)、PTX(3.2?g/mL)、Exo-PTX(1×10^9顆粒/mL)和cRGD-Exo-PTX(1×10^9顆粒/mL)孵育48小時。結(jié)果顯示，與PBS、游離PTX和Exo-PTX相比，cRGD-Exo-PTX能更有效地降低U87和U251細胞的細胞活力(圖5a，b)。然后，我們評估了這些培養(yǎng)物中的細胞凋亡率。與PBS、PTX和Exo-PTX處理相比，cRGD-Exo-PTX處理后，U87和U251細胞的凋亡百分比顯著增加(圖5c)。這些結(jié)果表明，cRGD-Exo-PTX對U87和U251細胞的抑制作用強于游離的PTX和Exo-PTX，證實了cRGD-Exo-PTX在體外具有較高的抗腫瘤作用。 六、cRGD-Exo-PTX的體內(nèi)靶向治療 受這些結(jié)果的鼓舞，我們進一步觀察了cRGD-Exo-PTX對皮下荷瘤小鼠的治療作用。小鼠每隔一天經(jīng)尾靜脈注射PBS(對照組，Ctl，125?L)、PTX(320?g/mL；125?L)、Exo-PTX(1×10^11顆粒/mL；125?L)和cRGD-Exo-PTX(1×10^11顆粒/mL；125?L)治療2周。如圖6a、b，在研究結(jié)束時，PTX、Exo-PTX和cRGD-Exo-PTX治療組，與PBS處理組相比顯著降低了腫瘤體積(PBS組778.7±165.4mm3，PTX組567.9±138.9mm3，p<0.05；Exo-PTX組242.2±109.0mm3，p<0.01；cRGD-Exo-PTX組81.2±14.0mm3)。與PTX和Exo-PTX組相比，cRGD-Exo-PTX組腫瘤生長明顯抑制(81.2±14.0mm3，cRGD-Exo-PTX組 VS 567.9±138.9mm3，PTX組，p<0.01；242.2±109.0mm3，Exo-PTX組，p<0.05)。各組患者的體重均無顯著性差異（圖S2）。此外，與PBS、PTX和Exo-PTX組相比，cRGD-Exo-PTX處理后Ki67陽性細胞數(shù)量顯著減少，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP末端標記(TUNEL)陽性細胞數(shù)量明顯增加(圖6c)。 為了評估cRGD-Exo-PTX的長期效果，我們記錄了原位腦腫瘤模型的總生存率。小鼠每隔一天經(jīng)尾靜脈注射PBS(對照組，Ctl，125?L)、ESC-exos(1×10^11顆粒/mL；125?L)、PTX(320?g/mL；125?L)、Exo-PTX(1×10^11顆粒/mL；125?L)和cRGD-Exo-PTX(1×10^11粒子/mL；125?L)。Kaplan-Meier生存曲線顯示，使用cRGD-Exo-PTX治療的原位腦瘤小鼠的平均生存率比其他組要長得多(圖6d)。這些結(jié)果表明，cRGD-Exo-PTX在體內(nèi)比ESC-exos、PTX和Exo-PTX具有更強的靶向治療能力。 總結(jié)： 綜上所述，我們在體內(nèi)外均證實了ESC-exos的GBM抑制作用。然后將ESC-exos與腫瘤靶向c(RGDyK)肽偶聯(lián)，并加載PTX，該工程外泌體被命名為cRGD-ExoPTX，已被證明具有良好的GBM靶向能力，并提高了PTX在GBM模型中的療效。綜上所述，我們的研究設計了一種新型的GBM靶向外泌體，并為腦腫瘤的治療提供了一個強有力的工具。 參考文獻： [1]Zhu, Q; Ling, X; Yang, Y; et al.Embryonic Stem Cells-Derived Exosomes Endowed with Targeting Properties as Chemotherapeutics Delivery Vehicles for Glioblastoma Therapy.[J].Adv Sci (Weinh).2019,6(6):180189 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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