 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 858 | 回復(fù): 0 | |||
NanoFCMlxq新蟲 (正式寫手)
|
[交流]
納米藥物相關(guān)研究文獻(xiàn)分享,輕松讀完一篇文獻(xiàn)（一）
|
|
今天分享一篇發(fā)表在ACS Nano（2021年IF=15.881）上的文章，名為《Light-Scattering Detection below the Level of Single Fluorescent Molecules for High-Resolution Characterization of Functional Nanoparticles》[1]（在單個(gè)熒光分子水平的光散射檢測，用于功能納米顆粒的高分辨表征）。 納米技術(shù)的最新進(jìn)展為開發(fā)有效的疾病診斷和治療方法提供了絕佳機(jī)會，因?yàn)槎喾N成像劑和治療藥物可以被納入納米顆粒(<100nm)中，用于靶向遞送。由于這些功能納米結(jié)構(gòu)材料本質(zhì)上是不均勻的，在單顆�；A(chǔ)上進(jìn)行高分辨率的物理和化學(xué)表征對于成功的臨床轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。除了測量顆粒大小分布外，生化特性，如治療劑封裝的數(shù)量或偶聯(lián)到單個(gè)納米載體表面的靶向配體的數(shù)量需要進(jìn)行分析，以對合成具有一致生物活性的納米藥物進(jìn)行監(jiān)控。然而，納米尺度的尺寸和有限的裝載分子數(shù)量使單納米顆粒表征成為納米醫(yī)學(xué)發(fā)展的最大挑戰(zhàn)之一。雖然單粒子技術(shù)在納米顆粒的檢測、大小和計(jì)數(shù)方面取得了顯著進(jìn)展，但通常缺乏對生化屬性的同時(shí)評估。 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)是一種成熟的技術(shù)，用于高通量、定量和單個(gè)細(xì)胞和微觀顆粒的多參數(shù)分析。關(guān)于顆粒大小、形狀和形態(tài)可以通過光散射檢測來收集。而生化性質(zhì)，如核酸含量、酶活性和生物細(xì)胞的抗原決定因素，可以通過熒光標(biāo)記來表征。然而，傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)基于光散射檢測直徑小于200nm的顆粒是非常困難的。使用定制的流式細(xì)胞儀檢測單個(gè)納米顆粒和病毒已經(jīng)付出了巨大的努力，直徑為74nm的聚合物納米顆粒是基于散射可靠檢測到的最小粒子。 在光學(xué)技術(shù)中，彈性光散射是最簡單和最直接的粒子檢測方法，因?yàn)樗恍枰獦?biāo)簽，適用于所有類型的材料，包括非熒光粒子和非金屬粒子。雖然單分子熒光檢測在實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)是常規(guī)操作，但單介電納米顆粒，如脂質(zhì)、聚合物、介孔二氧化硅和基于病毒載體的傳遞系統(tǒng)的光散射檢測仍然是一個(gè)重大挑戰(zhàn)。探測到這種粒子的困難有兩個(gè)主要原因。首先，根據(jù)瑞利散射理論，對于尺寸遠(yuǎn)小于入射光波長的球形納米粒子，散射光的強(qiáng)度與粒子尺寸有6次方的關(guān)系，散射截面(σscatt)由這個(gè)公式得出： 其中d為粒子直徑，λ為入射光的波長，Nmed為粒子周圍介質(zhì)的折射率，m為粒子與介質(zhì)的折射率比。這種強(qiáng)烈的尺寸依賴性使得非常小的粒子的散射光強(qiáng)在背景噪聲以下迅速消失。例如，直徑為25nm的二氧化硅納米顆粒的散射截面(σscatt)在532nm處僅為0.0081nm^2，不到一些典型單發(fā)色團(tuán)熒光染料的吸收截面(σabs)的1/3(1摩爾消光系數(shù)為68 000 M^(-1)cm^(-1)對應(yīng)0.026nm^2的吸收截面)。第二，用于實(shí)現(xiàn)單分子熒光檢測的技術(shù)，如光譜濾波檢測斯托克斯位移熒光發(fā)射和時(shí)間檢測延遲熒光光子自發(fā)散射光的排斥，不能將目標(biāo)粒子的散射光與背景區(qū)分開來。為克服測量散射強(qiáng)度的六倍尺度定律，應(yīng)用了干涉技術(shù)，將弱散射場與參考場相結(jié)合，檢測到的信號隨粒徑擴(kuò)展到三倍，而不是六倍。用干涉測量方法可以檢測直徑為30nm的單聚苯乙烯納米顆粒和直徑為10nm以下的單金納米顆粒。 本研究提出了高靈敏度流式檢測技術(shù)(HSFCM)的發(fā)展，該技術(shù)表明，通過直接測量散射強(qiáng)度，可以將直徑小至24nm二氧化硅和7nm的金納米顆粒彈性散射與背景區(qū)分開來。這種前所未有的靈敏度使高分辨率的納米顆粒檢測成為可能。通過同時(shí)熒光檢測，對阿霉素封裝化脂質(zhì)體和小干擾RNA(siRNA)負(fù)載的脂質(zhì)納米顆粒的研究，證明了臨床納米醫(yī)學(xué)的定量多參數(shù)表征的可能。 研究過程： 一、設(shè)備和檢測方案 對納米粒子進(jìn)行靈敏的光散射檢測的方法受到鞘流中單分子熒光檢測策略的啟發(fā)，即減小探測區(qū)體積，延長粒子傳輸時(shí)間以增加光子爆發(fā)量。然而，在我們早期的儀器設(shè)計(jì)中，用于熒光檢測的單光子計(jì)數(shù)雪崩光電二極管(APD)探測器由于背景散射容易飽和，不能應(yīng)用于單個(gè)納米粒子的光散射檢測。PMT探測器，檢測100nm聚苯乙烯信噪比(S/N)最高達(dá)到104。當(dāng)考慮到光散射與粒子大小的6次方的關(guān)系，為了檢測介電納米粒子直徑小到幾十納米，需要顯著提高靈敏度。圖1a為當(dāng)前HSFCM系統(tǒng)的設(shè)計(jì)示意圖。簡而言之，將一種納米顆粒懸浮液通過錐形石英毛細(xì)管(40μm i.d.)引入一個(gè)方孔鞘流比色管的中心。高速鞘液流可以將樣品流聚焦到一個(gè)非常細(xì)的流(～1.4μm)，穿過聚焦激光束的中心區(qū)域(直徑～16μm，除非另有說明)，在那里輻照最均勻。每個(gè)納米粒子以相同的速度通過激光束，經(jīng)歷相同的輻射場，從而為單個(gè)納米粒子的定量分析提供了基礎(chǔ)。垂直于入射激光器的光束和樣品流，從樣品流發(fā)射的光由無限校正的顯微鏡物鏡代替模玻璃凝膠非球面透鏡收集，然后由二向色分束器引導(dǎo)進(jìn)入兩條光路進(jìn)行側(cè)向散射(SS)和熒光(FL)檢測。在每條光路中，使用聚焦透鏡將激光束與樣本流的相交圖像投影到APD探測器上。硅APD探測器的活躍面積(直徑～180μm)作為一個(gè)限制孔徑，以排除從探測窗和鞘液流散射的激光。 通過對80nm的熒光二氧化硅納米顆粒的分析，證實(shí)了SS和FL的同時(shí)檢測，其熒光強(qiáng)度被校準(zhǔn)為AlexaFluor532(AF532)的425個(gè)等效可溶性熒光色素(MESF)分子(圖1b和支持信息圖1)。每個(gè)通過探測區(qū)的納米顆粒在SS和FL檢測通道上都產(chǎn)生一個(gè)脈沖或爆發(fā)的光電流。對于每一次爆發(fā)，檢測到的光子的總數(shù)被記錄為爆發(fā)面積。S/N比值以1min內(nèi)檢測到的3551個(gè)納米粒子的平均爆高除以背景信號（噪聲）的標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算，SS和FL檢測得到分別為486和561。還研究了激光功率對SS和FL的影響。雖然熒光的信噪比在大約5mW時(shí)達(dá)到最大值，此后隨著熒光飽和而開始下降，但隨著激光功率的增加，光散射的檢測靈敏度繼續(xù)增加(圖1c和支持信息圖2)。這些結(jié)果表明，較高的激光激發(fā)能量密度可以用來增強(qiáng)單個(gè)納米粒子的散射光。 二、在低納米尺寸范圍內(nèi)的單個(gè)納米粒子的光散射檢測 利用當(dāng)前系統(tǒng)可用的最大激光功率(160mW)和直徑～6.4μm的聚焦激光點(diǎn)，嘗試對低納米尺寸范圍內(nèi)的二氧化硅和金納米顆粒進(jìn)行單個(gè)納米顆粒的光散射檢測（支持信息部分1和圖3）。圖2a1中的代表性爆跡數(shù)據(jù)表明，直徑為29nm的單個(gè)二氧化硅納米顆粒(σscatt=0.020nm^2)，S/N比為27。對信號與背景噪聲的良好區(qū)分得到了一個(gè)明確的SS爆發(fā)區(qū)域分布(圖2a2)。對24nm的二氧化硅納米顆粒(σscatt=0.0063nm^2)的光散射檢測，S/N比為7，盡管它們的產(chǎn)光能力僅相當(dāng)于0.3個(gè)AlexaFluor532分子（支持信息第3部分）。另一方面，由于二氧化硅（1.46）和聚苯乙烯（1.59）在532nm處的折射率差，二氧化硅納米顆粒的散射光大約是相同尺寸的聚苯乙烯納米顆粒的1/4。因此，本研究將～75nm的聚苯乙烯納米顆粒的檢測極限提高到～25nm的二氧化硅納米顆粒，靈敏度提高了超過3個(gè)數(shù)量級。為了進(jìn)一步證明HSFCM體系的靈敏度，我們分析了尺寸要小得多的金納米顆粒。利用局部表面等離子體共振，分別檢測到32個(gè)直徑小于10.4和6.7nm的單金納米顆粒，S/N比分別為53(圖2c)和5(圖2d)。我們將HSFCM在檢測單納米粒子的顯著靈敏度歸功于以下幾個(gè)方面作用：（1）進(jìn)一步減少檢測體積～10fL，通過減少樣品流直徑和聚焦激光束點(diǎn)大小減少背景；（2）相對延長粒子停留在激光束(～0.3ms)和相對較高的激光激發(fā)能量密度(～5.0x10^5W/cm2或～1.3x10^24光子/s·cm2)的時(shí)間，產(chǎn)生更多的散射光子（～2x10^4對于24nm硅納米顆粒）；（3）使用一個(gè)光子計(jì)數(shù)APD探測器實(shí)現(xiàn)高量子效率的光子檢測；（4）良好的光學(xué)限制視場使得APD探測器可單獨(dú)探測樣本流，排除背景干擾。 三、基于散射光強(qiáng)度的單個(gè)納米粒子的高分辨率尺寸分析 接下來我們通過分析5種不同大小單分散二氧化硅納米顆粒的混合物，從40到90nm（支持信息圖4），檢查了HSFCM對不同納米顆粒大小的分辨能力。為了避免大顆粒的APD飽和，并在樣品流中提供更均勻的輻射場，將激光功率設(shè)置為16mW，聚焦激光束寬度為～16μm。一個(gè)典型的SS脈沖圖顯示，峰值高度聚集在五個(gè)不同的振幅水平附近，這對應(yīng)于五種不同大小的納米粒子群(圖3a)。因?yàn)榱Ｗ臃治鏊俣瓤梢越咏?00~200事件每秒，通過在1min內(nèi)快速檢測成千上萬的納米顆粒得到SS爆發(fā)面積的統(tǒng)計(jì)直方圖，并且不同群基線分離(圖3b)。值得注意的是，光散射對粒子大小的六次方的依賴性可能是一把雙刃劍。一旦達(dá)到足夠的靈敏度，10%的顆粒直徑差異就意味著大約77%的光散射強(qiáng)度差異，從而實(shí)現(xiàn)對納米顆粒尺寸的高分辨率檢測。 當(dāng)通過動態(tài)光散射(DLS)檢測五種不同尺寸的二氧化硅納米顆粒的懸浮液時(shí)，在尺寸分布圖中觀察到顯著的重疊(圖3d)。當(dāng)通過擬合高斯曲線得到SS爆發(fā)質(zhì)心(圖3b)與通過透射電子顯微鏡(TEM)得到每群納米粒子直徑中位數(shù)(圖3c)繪制函數(shù)，結(jié)果曲線表現(xiàn)出一個(gè)大約六次方的相關(guān)關(guān)系，非常符合瑞利散射理論(圖3e)。利用這條校準(zhǔn)曲線，通過計(jì)算SS爆發(fā)面積可以得到粒徑，由此得到的尺寸分布(圖3f)與TEM確定的尺寸分布非常相似(圖3c)。透射電鏡是最常用的納米顆粒尺寸和形態(tài)表征的技術(shù)，但它不能在生物學(xué)相關(guān)的條件下操作，并且在產(chǎn)生大量統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)方面的用途有限。通過提供快速(12min)和統(tǒng)計(jì)上可靠的納米顆粒尺寸分布分析，HSFCM可以作為TEM方法的補(bǔ)充，用于功能納米顆粒的常規(guī)分析和質(zhì)量控制。這種技術(shù)的一個(gè)有益應(yīng)用可能是納米藥物的臨床前物理化學(xué)表征，包括測量其大小分布和聚集或團(tuán)聚狀態(tài)。 四、攜帶阿霉素的脂質(zhì)體的粒徑及藥物含量分析 在納米醫(yī)學(xué)的發(fā)展中，納米顆粒被用作載體來傳遞諸如治療藥物等有效成分；因此，同時(shí)檢測納米顆粒及其裝載物是可取的。Doxil（攜帶阿霉素的脂質(zhì)體）是FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)納米藥物（1995年），DLS和冷凍透射電鏡是兩種最常用的尺寸分析方法。為了評估將HSFCM應(yīng)用于納米藥物特性的可行性，我們將物理特性和藥代動力學(xué)與Doxil相似的聚乙二醇脂質(zhì)體的研究級產(chǎn)品 Doxoves作為模型系統(tǒng)進(jìn)行分析。圖4a、b分別提供了Doxoves具有代表性的冷凍透射電鏡圖像和粒徑分布直方圖。在單個(gè)顆粒之間可以觀察到大小和阿霉素含量的顯著區(qū)別。通過統(tǒng)計(jì)橢圓形脂質(zhì)體的長軸和短軸的平均值為62±11nm。值得注意的是，當(dāng)阿霉素在脂質(zhì)體顆粒內(nèi)結(jié)晶時(shí)，其熒光與溶液中的游離藥物相比會更易被猝滅。盡管顆粒尺寸小且熒光猝滅顯著（～17倍，支持信息圖5），圖4c表明HSFCM足夠靈敏，可以檢測每個(gè)脂質(zhì)體發(fā)出的散射光和阿霉素的內(nèi)在熒光。在短短1個(gè)min中，分析了超過10 000 個(gè)粒子，可快速生成統(tǒng)計(jì)上穩(wěn)健的分布(圖4d)。值得注意的是，顆粒大小和藥物含量在單顆粒水平上存在相關(guān)，并呈正相關(guān)。 由于二氧化硅納米顆粒和脂質(zhì)囊泡的折射率相當(dāng)，我們使用單分散二氧化硅納米顆粒作為標(biāo)準(zhǔn)來校準(zhǔn)Doxoves納米顆粒的尺寸測量值(圖4e)，并在幾分鐘內(nèi)獲得了分布良好的高斯分布(圖4f)。以這種方式測量的中位數(shù)與冷凍透射電鏡測量結(jié)果吻合，而且更具有統(tǒng)計(jì)代表性。然而，值得注意的是，除了顆粒的形狀，在一定波長下，脂質(zhì)體的平均折射率是由其水含量和膜上脂質(zhì)的折射率(488nm處～1.48)和囊泡中脂質(zhì)部分體積決定的。阿霉素在脂質(zhì)體內(nèi)的包封和結(jié)晶也使問題變得復(fù)雜。因此，如果要使用二氧化硅納米顆粒來精確校準(zhǔn)不同的脂質(zhì)體的大小，必須謹(jǐn)慎，因?yàn)榭赡軙x真實(shí)值。然而，考慮到用于藥用脂質(zhì)體特性的方法非常有限，HSFCM具有相當(dāng)大的優(yōu)勢，因?yàn)樗梢栽趩瘟Ｗ铀胶蛻乙褐锌焖偻瑫r(shí)分析粒徑分布和藥物含量。 五、基因傳遞系統(tǒng)中siRNA加載的粒子計(jì)數(shù)和片段檢測 除了基于納米顆粒的化藥治療，納米顆粒介導(dǎo)的基因治療在過去的二十年里，受到了相當(dāng)多的關(guān)注。封裝siRNA的脂質(zhì)納米顆粒(LNPs)是目前最廣泛的經(jīng)過臨床驗(yàn)證的實(shí)現(xiàn)RNA干擾的手段。然而，確定精確的粒子計(jì)數(shù)和負(fù)載粒子的比例具有挑戰(zhàn)性。雖然原則上可以在冷凍透射電鏡圖像中計(jì)算粒子，但在電子顯微鏡網(wǎng)格上，玻璃化樣品中LNP分布的不均勻性使得很難獲得精確的粒子計(jì)數(shù)。此外，空的和siRNA負(fù)載的LNPs具有相當(dāng)?shù)拇笮�、形狀和電子密度，這使得冷凍透射電鏡在測定siRNA負(fù)載的比例方面效果較差。 我們實(shí)現(xiàn)了用HSFCM來表征siRNA負(fù)載的LNPs，其成分與目前用于臨床試驗(yàn)的LNPs相同。siRNA加載LNPs和空的LNPs作為對照（Alnylam）。首先，使用80nm的熒光二氧化硅納米顆粒作為內(nèi)標(biāo)，測量siRNA負(fù)載的LNPs(siRNA濃度為0.1mg/mL)的顆粒濃度為7.0x10^12顆粒/mL(圖5a)。根據(jù)封裝的siRNA的濃度和分子量(～13 500 Da)，計(jì)算出LNPs每個(gè)粒子平均含有～650個(gè)siRNA。這種單粒子計(jì)數(shù)方法簡單（無需標(biāo)簽）且快速（分鐘），并且不需要已知質(zhì)量密度或規(guī)則形狀。接下來，用空的和裝載siRNA的LNP樣品進(jìn)行熒光染色分析。SYTO82是一種標(biāo)記核酸的透膜染料。圖5b顯示，基于熒光信號，空siRNA和負(fù)載LNPs之間實(shí)現(xiàn)完全的區(qū)分，siRNA負(fù)載的比例約為100%。通過DLS測量，確定空LNPs和siRNA負(fù)載LNPs的平均尺寸分別為45±14和54±13nm。因此，LNP樣品的SS爆發(fā)區(qū)分布非常廣泛，很可能是由于粒徑的較大的內(nèi)在變化，由于粒徑的六次方依賴，散射光強(qiáng)的變化可以顯著放大。 結(jié)論： 綜上所述，我們的研究首次證明，HSFCM通過直接測量散射光強(qiáng)度，可以對單個(gè)熒光分子水平下的單個(gè)納米粒子進(jìn)行光散射檢測。最值得注意的是，采用鞘流系統(tǒng)來限制樣品流，并將其隔離在遠(yuǎn)離流動通道壁的地方，對于探測體積減少和有效地阻擋來自比色管窗口的散射光是必不可少的。通過將單個(gè)納米顆粒的光散射檢測尺寸限制分別降低到24nm二氧化硅和7nm金納米顆粒，HSFCM使分析以前難以表征的納米顆粒成為可能。與其他新開發(fā)的單粒子技術(shù)相比，通過當(dāng)前的熒光檢測同時(shí)評估各種顆粒相關(guān)的生化性質(zhì)是HSFCM的一個(gè)明顯的優(yōu)勢。我們的研究結(jié)果將流式細(xì)胞術(shù)的適用性和通用性從微米和亞微米大小的粒子范圍擴(kuò)展到納米尺度。除了納米藥物和其他合成納米顆粒的特性外，我們預(yù)計(jì)HSFCM將為生物納米顆粒的定量多參數(shù)分析開辟新的途徑，包括病毒、細(xì)胞器、細(xì)胞來源的外泌體和蛋白質(zhì)組裝。 參考文獻(xiàn)： [1]Zhu, S; Ma, L; Wang, S; et al.Light-scattering detection below the level of single fluorescent molecules for high-resolution characterization of functional nanoparticles.[J].ACS Nano.2014,8(10):10998-1006 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
新疆大學(xué)地質(zhì)與礦業(yè)工程學(xué)院招生
已經(jīng)有10人回復(fù)
-
招調(diào)劑
已經(jīng)有11人回復(fù)
-
0856材料與化工求調(diào)劑！
已經(jīng)有11人回復(fù)
-
材料與化工304求調(diào)劑
已經(jīng)有10人回復(fù)
-
歡迎211本科同學(xué)，過A區(qū)國家線，A區(qū)非偏遠(yuǎn)一本，交叉學(xué)科課題組
已經(jīng)有23人回復(fù)
-
A區(qū)一本交叉課題組，低分調(diào)劑，招收機(jī)械電子信息通信等交叉方向
已經(jīng)有31人回復(fù)
-
中科大材料299求調(diào)劑
已經(jīng)有7人回復(fù)
-
301求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
材料考研339求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
材料專碩290求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 NanoFCMlxq 的主題更新
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +3 | 52hz~~ 2026-03-05 | 4/200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 328求調(diào)劑 +6 | vuzhdkfjkx 2026-03-04 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 268求調(diào)劑 +3 | 劉合華 2026-03-05 | 3/150 |
|
|
[考研] 材料調(diào)劑 +4 | ounce. 2026-03-04 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料學(xué)碩318求調(diào)劑 +19 | February_Feb 2026-03-01 | 21/1050 |
|
|
|
[考研]
材料學(xué)學(xué)碩308分/本科東北大學(xué)/一志愿西北工業(yè)大學(xué)/
 5+3
|
蘇堯幺幺 2026-03-03 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +3 | 曼殊2266 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工（高分子）290分求調(diào)劑 +8 | wengyujian 2026-03-04 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +7 | 曼殊2266 2026-02-28 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 289求調(diào)劑 +8 | yang婷 2026-03-02 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 0703 總分319求調(diào)劑 +4 | Xinyuu 2026-03-02 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 291求調(diào)劑 +4 | Afy123456 2026-03-03 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 085700資環(huán)求調(diào)劑，初始279，六級已過，英語能力強(qiáng) +3 | 085700資環(huán)調(diào)劑 2026-03-03 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工調(diào)劑 280分 +10 | yyqqhh 2026-03-03 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 化學(xué)0703求調(diào)劑 學(xué)碩 理/工科均可 總分279 +3 | 1一11 2026-03-03 | 5/250 |
|
|
|
[考研]
材料工程專碩283求調(diào)劑
5+8
|
，��？ 2026-03-02 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 298求調(diào)劑 +7 | axyz3 2026-02-28 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 材料085601調(diào)劑 +5 | 多多子. 2026-03-02 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料與化工328求調(diào)劑 +3 | 。，。，。，。i 2026-03-02 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0856材料求調(diào)劑 +4 | 麻辣魷魚 2026-02-28 | 4/200 |
|