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科研bxnb新蟲 (初入文壇)
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[交流]
RNA sequencing
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轉(zhuǎn)錄組是指某個物種或特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下產(chǎn)生的所有RNA的總和,包括mRNA和非編碼RNA(Non-coding RNA)。目前研究較多的非編碼RNA又包括:circRNA,miRNAs,及l(fā)ncRNAs等。基于高通量測序平臺的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)能夠全面獲得物種特定組織或器官的轉(zhuǎn)錄本信息,從而進(jìn)行基因表達(dá)水平研究、新轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)研究、轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)變異研究等。 全轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)主要針對circRNA、lncRNA和mRNA,一舉三得,一次測序可以同時得到三者分子的表達(dá)情況,可應(yīng)用于新circRNA和lncRNA預(yù)測以及已知circRNA和lncRNA表達(dá)水平研究等。 技術(shù)路線 • Total RNA提取:根據(jù)不同的樣品類型采用不同的提取方案,獲得高質(zhì)量的Total RNA。 • RNA質(zhì)量檢測:Nanodrop檢測RNA樣品濃度及純度;瓊脂糖凝膠電泳及Agilent 2100 Bioanalyzer檢測RNA樣品完整性。 • rRNA去除:針對不同物種選擇合適的rRNA去除試劑盒去除樣品中的rRNA。 • RNA片段化:采用mg2+離子打斷的方法,將RNA片段化至200-300bp。 • cDNA合成:隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈;在合成cDNA第二鏈時摻入dUTP標(biāo)記第二鏈,保留了RNA的鏈方向性。 • 加A尾,接頭連接:cDNA兩端引入接頭序列及標(biāo)記樣品的index序列。 • PCR富集  CR富集文庫片段,文庫大小為300-400bp。• 文庫質(zhì)檢:Agilent 2100 Bioanalyzer檢測文庫大小分布,Qubit 3.0或熒光定量PCR測定文庫濃度。 • 上機(jī)測序:根據(jù)數(shù)據(jù)量要求將文庫pooling上機(jī)測序。 • 數(shù)據(jù)分析:下機(jī)數(shù)據(jù)由專業(yè)生物信息分析團(tuán)隊進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,提供全面數(shù)據(jù)分析報告。 樣品要求 • 樣品類型:細(xì)胞、新鮮組織或RNA樣品。 • 樣品量:細(xì)胞樣品請?zhí)峁┲辽?×106個細(xì)胞,組織樣品請?zhí)峁┲辽?00 mg的組織塊或切片,RNA樣品請?zhí)峁? μg以上的總RNA。 • 樣品質(zhì)量:RNA無明顯降解,提取的總RNA,OD260/280值在1.8~2.2之間,濃度≥500 ng/μL,28S:18S ≥ 1.5,RIN ≥ 7。 • 樣品保存: 細(xì)胞樣品:收集細(xì)胞至RNase Free 1.5 mL EP管,棄去培養(yǎng)基,用PBS洗一次,棄去PBS,把細(xì)胞沉淀保存在-80℃。 組織樣品:組織樣品離體后放在凍存管中,迅速置于液氮下速凍1分鐘以上,然后保存在-80℃。 RNA樣品:可將RNA溶于RNase Free 的超純水中,-80℃保存。 樣品保存期間避免反復(fù)凍融。 • 樣品運輸:樣品置于1.5 mL管中,封口膜封好,干冰運輸。 測序方案 測序模式 PE150 測序數(shù)據(jù)量 10Gb clean data 生物信息分析內(nèi)容 • 基礎(chǔ)分析: 1 原始數(shù)據(jù)質(zhì)控檢查 2 比對結(jié)果質(zhì)控檢查 3 基于基因表達(dá)的樣品主成分分析 4 差異基因表達(dá)及相關(guān)通路富集分析 5 circRNA預(yù)測及鑒定 6 circRNA差異分析 7 差異circRNA宿主基因的通路富集分析 8 差異circRNA的靶向miRNA預(yù)測分析 9 長鏈非編碼RNA差異分析 • 高級分析: 1 基于基因表達(dá)的通路活性分析 2 轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性分析及通路互作分析 3 差異長鏈非編碼RNA的調(diào)控基因的通路富集分析 4 circRNA及靶向miRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控制圖 |
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