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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 生物科學 » 層析/純化 » RRBS甲基化測序
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科研bxnb新蟲 (初入文壇)
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RRBS甲基化測序 已有1人參與
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DNA甲基化研究一直是疾病研究的熱點,與基因表達、表型性狀息息相關。是基因調控的手段之一,通過對位于啟動子及第一外顯子區(qū)的CpG島的甲基化而抑制基因的表達。在維持細胞正常功能、傳遞基因組印記,胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生等方面起著至關重要的作用。 RRBS(Reduced Representation Bisulfite Sequencing)是一種準確且高性價比的DNA甲基化研究方法,在大規(guī)模臨床樣本的研究中有著廣泛的應用。RRBS通過限制性內切酶對基因組進行酶切,富集啟動子及CpG島區(qū)域,再進行Bisulfite轉化,用較小的數據量得到包含最多CpG位點甲基化信息的單堿基精度的甲基化圖譜。 • 基因組DNA提取:根據不同的樣品類型采用不同的提取方案,獲取高質量的基因組DNA。 • DNA質量檢測:Qubit檢測DNA樣品濃度,瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品完整性。 • MspⅠ酶切:通過酶切富集CpG片段。 • 末端修復,加A,甲基化接頭連接:在DNA分子兩端引入接頭序列及index序列。 • 選擇CpG富集的DNA片段 • Bisulfite轉化:通過Bisulfite作用將非甲基化堿基C轉化成U。 • PCR富集  CR擴增富集文庫片段。• 文庫質檢:Agilent 2100 Bioanalyzer檢測文庫大小分布,Qubit 3.0或熒光定量PCR測定文庫濃度。 • 上機測序:根據數據量要求將文庫pooling上機測序。 • 數據分析:下機數據由專業(yè)生物信息分析團隊進行數據分析,提供全面數據分析報告。 樣品要求 • 樣品類型:細胞、新鮮組織或DNA樣品。 • 樣品量:細胞樣品請?zhí)峁┲辽?×106個細胞,組織樣品請?zhí)峁┲辽?-3 g的組織塊或切片,DNA樣品請?zhí)峁? μg以上的總DNA。 • 樣品質量  NA無明顯降解,無蛋白污染,OD260/280值≥1.5,OD260/230值≥1.0,濃度≥50 ng/μL,• 樣品保存: 細胞樣品:收集細胞至RNase Free 1.5 mL EP管,棄去培養(yǎng)基,用PBS洗一次,棄去PBS,把細胞沉淀保存在-80℃。 組織樣品:組織樣品離體后放在凍存管中,迅速置于液氮下速凍1分鐘以上,然后保存在-80℃。 DNA樣品:可將DNA溶于Nuclease Free 的超純水中,-20℃保存。 樣品保存期間避免反復凍融。 • 樣品運輸:樣品置于1.5 mL管中,封口膜封好,冷凍運輸。 測序方案 測序模式 PE150 測序數據量 7.5Gb clean data 生物信息分析內容 1 原始數據質控檢查; 2 甲基化序列比對結果分析; 3 測序深度及覆蓋度統(tǒng)計; 4 計算C堿基的甲基化水平; 5 DNA甲基化信號在基因組的分布; 6 DNA甲基化信號的基因組元件注釋; 7 DNA甲基化圖譜繪制; 8 差異甲基化區(qū)域分析; |
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2樓2022-06-25 17:59:53
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3樓2022-09-29 13:45:44
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