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醫(yī)學(xué)生物科研銅蟲 (小有名氣)
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免疫組化實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn)，新手快速入門必看!
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免疫組織化學(xué)(immunohistochemistryIHC)是一門利用酶、熒光素、生物素、重金屬離子等作為示蹤劑，通 過免疫親和(抗原抗體特導(dǎo)性結(jié)合)在組織切片或細(xì)胞薄片上原位顯示追蹤生物體內(nèi)大分子物質(zhì)動(dòng)態(tài)變化 規(guī)律的實(shí)用性染色技術(shù)。按其主要示蹤原理可以分為免疫組化(默認(rèn)酶標(biāo)法)、免疫熒光法、膠體金法等 作用:通過顏色來顯示蛋白質(zhì)的有無、定位(胞外、胞膜、胞漿、胞核)、含量變化 一、樣本種類: 按來源:①組織;②培養(yǎng)細(xì)胞 按制作方式:①石蠟片(IHC-P)②冰凍片(IHC-F)③細(xì)胞片(ICC) 免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟解析01 取材 快:盡是半小時(shí)內(nèi)取材完成 準(zhǔn):刀、剪鋒利，一步到位，輕夾輕放 大小:1cmx1cmX02cm左右最宜 02固定 何時(shí)固定? 取材后立刻!馬上!用什么固定? 4%多聚甲醛或福爾馬林較通用，有致志外膜用Canov液，活檢用Bouin液 固定液用多少? 組織體積20倍以上最宜。量少應(yīng)中途換液1-3次固定多久? 6-24h最佳。固定后盡快包埋成蠟塊(蠟塊可保存幾年時(shí)間而不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果)，固定越久所需修復(fù)強(qiáng)度越大，越容易出現(xiàn)自發(fā)熒光及非特異性染色。 03切片 要保存簡(jiǎn)單 --選石蠟片!要速度快 --選冰凍片! 要結(jié)構(gòu)漂亮 --選石蠟片! 抗原不穩(wěn)定 --選冰凍片!抗原穩(wěn)定 --石蠟片冰凍片皆可! 04烤片切多厚? 石蠟片3-8um，一般5um;冰凍片5-15um，一般8um 石蠟片怎么撈片? 水溫40-45℃組織平整后玻片有油漆的一面貼近組織向斜上方提起 烤多久? 37℃過夜或60℃1-2h 注意:使用防脫處理的玻片，冰凍片無需烤片 05 脫蠟至水 Step1:二甲苯(7min) Step2:二甲苯(7min) Step3:二甲苯(7min) Step4:100%酒精(7min) Step5:85%酒精(7min) Step6:70%酒精(7min) 注:具體脫蠟時(shí)間可結(jié)合室溫做調(diào)整，以組織上的石蠟脫干凈為準(zhǔn)。 06滅活 ①一般組織使用3%HzO2室溫孵育10min 內(nèi)源性過氧化物酶在血管瘤肝胎盤、闌尾炎，壞死區(qū)域和急性炎癥組織含量較高，這樣的組織可以適當(dāng)延長滅活時(shí)間 顯色系統(tǒng)為過氧化物酶(HRP)系統(tǒng)，該步驟建議一定要做 堿性磷酸酶(AP)系統(tǒng)以及免疫熒光，該步可以不做 在滅活時(shí)，如組織片中出現(xiàn)細(xì)小且密集的氣泡，表示過氧化物酶含量過高，這時(shí)用3%H2Oz溶液難以完全阻斷，可以用0.5%高碘酸溶液室溫條件孵育10min 07 抗原修復(fù) 抗原修復(fù)方式: 酶修復(fù)、高壓熱修復(fù)、微波熱修復(fù)。微波熱修復(fù)一般都能得到很好的效果 修復(fù)液的選擇: 檸檬酸鹽緩沖液(PH60)和EDTA(PH80或9.0)。經(jīng)驗(yàn)證對(duì)于大多數(shù)的抗體來說后者使用效果更優(yōu) 修復(fù)強(qiáng)度的選擇: 固定時(shí)間越久，修復(fù)強(qiáng)度越強(qiáng)，舊標(biāo)本修復(fù)強(qiáng)度強(qiáng)于新鮮標(biāo)本 消化酶的使用: 不同的蛋白有最佳的消化酶，使用中要注意各種消化酶的最佳PH值 8封閉 05%BSA最常用 @血清，效果最全面 封閉血清與二抗同源(比如二抗是山羊抗小鼠gG，封閉液選擇山羊血清)，與一抗不能同源09 抗體孵育 0單抗和多抗各有優(yōu)勢(shì)，按需選用 一抗4C孵育效果最佳，備選37℃1-2h 二抗需與一抗的種屬、類別或亞類相匹配推薦護(hù)、山羊、綿羊等種屬 0二抗/SABC一般37℃孵育30min10顯色 0DAB顯色液現(xiàn)用現(xiàn)配②建議鏡下控制反應(yīng)時(shí)間 根據(jù)顯色時(shí)間的長短反向優(yōu)化前期的實(shí)驗(yàn)條件 11 復(fù)染/返藍(lán) oMayerS蘇木素復(fù)染(不易過染) 堿性溶液浸泡返藍(lán)(如氨水、飽和磷酸氫二鈉溶液等) 免疫熒光實(shí)驗(yàn)可選用DAPI等核染料復(fù)染細(xì)胞核，無需做返藍(lán) 12 脫水透明 Step1:70%酒精(3min) Sted2:85%灑精(3min) Step3:100%酒精(3min) Step4:二甲苯(3min) Step5:二甲苯(3min) Step6:二甲苯(3min) 注:免疫熒光實(shí)驗(yàn)，該步驟可以不做。13 封片 ①DAB顯色用中性樹膠封片 2免疫熒光建議用抗熒光衰減封片劑 AEC顯色用水溶性封片劑 |
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