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醫(yī)學(xué)生物科研銅蟲(chóng) (小有名氣)
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Western Blot
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簡(jiǎn)介: 蛋白質(zhì)印跡的發(fā)明者一般認(rèn)為是美國(guó)斯坦福大學(xué)的喬治·斯塔克(George Stark)。在尼爾·伯奈特(Neal Burnette)于1981年所著的《分析生物化學(xué)》(Analytical Biochemistry)中首次被稱(chēng)為Western Blot。蛋白免疫印跡( Western Blot) 是將電泳分離后的細(xì)胞或組織總蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上,然后用特異性抗體檢測(cè)某特定抗原的一種蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù),現(xiàn)己廣泛應(yīng)用于基因在蛋白水平的表達(dá)研究、抗體活性檢測(cè)和疾病早期診斷等多個(gè)方面。 原理: 與Southern Blot或Northern Blot雜交方法類(lèi)似,但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,被檢測(cè)物是蛋白質(zhì),“探針”是抗體,“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離的蛋白質(zhì)樣品,轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上,固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì),且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng),經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。 Western Blot顯色的方法主要有以下幾種: i. 放射自顯影 ii. 底物化學(xué)發(fā)光ECL iii. 底物熒光ECF iv. 底物DAB呈色 現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色,體同水平和實(shí)驗(yàn)條件的是用第一種方法,發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。只要買(mǎi)現(xiàn)成的試劑盒就行,操作也比較簡(jiǎn)單,原理如下(二抗用HRP標(biāo)記):反應(yīng)底物為過(guò)氧化物+魯米諾,如遇到HRP,即發(fā)光,可使膠片曝光,就可洗出條帶。 |
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