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醫(yī)學(xué)生物科研銅蟲 (小有名氣)
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病理染色之Van Gieson染色實驗
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VG染色法是利用兩種陰離子染料混合或先或后作用而完成鑒別染色的。 膠原纖維呈紅色（被麗春紅所染）肌纖維呈黃色（被苦味酸所染），這與陰離子染料分子的大小和組織的滲透性有關(guān)。組織的滲透性，取決于組織的結(jié)構(gòu)密度，如細致觀察，會發(fā)現(xiàn)組織和細胞成分都是多孔的構(gòu)造。不同的組織和細胞成分，它們的空隙大小是不同的，空隙的大小，決定了組織的滲透性，如空隙小，組織結(jié)構(gòu)致密，滲透性低；空隙寬，組織結(jié)構(gòu)疏松，滲透性高。如已固定的組織用一系列陰離子水溶性染料先后或混合染色，則可發(fā)現(xiàn)紅細胞被最小分子的陰離子染料著染。由此說明紅細胞對陰離子染料的滲透性最小。肌纖維與胞質(zhì)次之，而膠原纖維具有最大的滲透性。 根據(jù)組織不同的滲透性能，選擇分子大小不同的陰離子染料進行染色，便可把不同組織成分顯示出來。染料分子的大小，主要由其分子量來體現(xiàn)。一般來說小分子量者易于穿透結(jié)構(gòu)致密，滲透性低的組織，而大分子染料只能進入結(jié)構(gòu)疏松，滲透性高的組織。常用膠原纖維染色而幾種陰離子染料的分子量由小到大分別是： 苦味酸（黃色），分子量229.11 橙黃G（橙黃色）分子量452 麗春紅（紅色）分子量480.42 酸性品紅（紅色）分子量585.53 苯胺藍（藍色）分子量737.72 亮綠（綠色）分子量792.72 甲基藍（藍色）分子量799 因此，在Van Gieson氏法中，苦味酸染紅細胞和肌纖維，酸性品紅染膠原纖維。 02試劑配制 Ponceau染色液： 0.5%ponceau(麗春紅S)水溶液10-15ml，苦味酸飽和水溶液85-90ml。 Victoria Blue’B染色液： Victoria Blue’B（維多利亞藍B）0.5g，70%乙醇100ml。 03染色步驟 中性甲醛液固定組織，石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。 70%乙醇稍洗后，浸入Victoria Blue’B染色液中15ml。 95%乙醇中分化數(shù)秒鐘。 用蒸餾水洗2次 用Ponceau染色液滴染5min。 直接用無水乙醇分化與脫水。 二甲苯透明，中性樹膠封固。 顯微鏡觀察。 04樣本說明 石蠟切片 取材：1、組織離體后需及時固定；2、組織標本不宜過大、過厚。 固定：1、固定液：10%福爾馬林（4%多聚.甲醛）或10%中性甲醛；2、用量：一般固定液的量與組織體積比為10:1～20:1；3、固定：適宜的固定時間，主要根據(jù)材料的大小、松密程度及固定液的穿透速度而定。 保存：切片經(jīng)60℃烤片3-5小時后，可于常溫或4℃干燥保存。 冰凍切片 取材：取材后需立即置于超低溫冰箱或液氮中保存。 固定：樣本冰凍切片后，應(yīng)立即放入甲醇、丙.酮、95%酒精、4%多聚.甲醛等固定液中固定。 保存：固定好的切片自然風(fēng)干，密封后置于-80℃、-20℃保存，盡快用于后續(xù)實驗。 細胞塊石蠟切片 細胞量較多的樣品，可離心分離所需細胞，用中性甲醛固定后制作成瓊脂細胞塊，然后按照制作石蠟切片的操作流程進行切片。 細胞爬片 在孔板里做的細胞爬片，爬片取出后，用PBS洗滌2次（根據(jù)研究目的，PBS洗滌可選擇不做），用4%多聚.甲醛4℃固定15分鐘，將表面液體吹干，置于-20℃保存。若在短時間內(nèi)即開展實驗，可在加固定液后，于4℃冰箱中放置一段時間。 細胞涂片 細胞涂片常用的固定液有95%酒精（最為常用）、酒精-冰醋.酸液、Ethyl ether-酒精液和Carney’s液等。 05注意事項 膠原纖維切片的厚度需6um，使之對比清晰。 Victoria Blue’B染色液應(yīng)盛染色缸內(nèi)，進行浸染色。 Ponceau染色后，不能與水接觸，直接用無水乙醇沖洗脫水。 在Van Gieson氏染色，苦味酸與酸性品紅濃的比例若不恰當，如苦味酸的濃度太高，小分子量染料苦味酸占優(yōu)勢，則結(jié)構(gòu)致密的胞漿，肌纖維和結(jié)構(gòu)疏松的膠原纖維都會被苦味酸所著染。 06 鮮紅色：膠原纖維；黃色：肌纖維、細胞質(zhì)、紅細胞；藍褐色：胞核 卵巢組織：膠原纖維呈紅色；血管壁肌層呈黃色；細胞核呈黑色。 心肌梗塞（2月），壞死心肌被染成紅色的纖維組織所代替，黃色區(qū)域為殘留的心肌纖維。 07 來源于間胚葉的腫瘤，如纖維瘤、平滑肌瘤、橫紋肌瘤、神經(jīng)纖維瘤甚至它們的肉瘤等都產(chǎn)生一定的纖維，這些纖維在H-E染色中都染成紅色而難以區(qū)別。通過用上述方法染色，一般可區(qū)分出該腫瘤組織是膠原纖維源性，還是肌源性，或者是神經(jīng)纖維源性。對于后者，有時還需加染磷鎢酸蘇木素來協(xié)助診斷。 在慢性炎癥，機化和瘢痕形成中，可隨病理過程的發(fā)展而出現(xiàn)膠原纖維。在早期，H-E染色切片中的這些纖維往往和纖維蛋白很難鑒別，通過膠原纖維染色則可證實。如慢性腎小球腎炎的腎小球纖維化后，V.G.染色呈紅色。大葉性肺炎或血栓發(fā)生機化后，原有的纖維蛋白灶內(nèi)出現(xiàn)膠原纖維，V.G.染色呈紅色。風(fēng)濕性肉芽腫已靜止時，阿嘯夫氏(Aschoff's)。巨細胞消失，病灶內(nèi)的纖維被膠原纖維取代，V.G.染色也呈紅色。胃、十二指腸潰瘍愈復(fù)時，在漬瘍底部出現(xiàn)膠原纖維構(gòu)成的疤痕，慢性闌尾炎時闌尾壁出現(xiàn)的纖維化，肝硬化時膠原纖維的增生，這些用V.G。染色也都染成紅色。 血管壁的膠原纖維染色對病理診斷也很重要。良性高血壓，小動脈的玻璃樣變，V.G.染色陽性。惡性高血壓病時，小動脈管壁為纖維素樣壞死，V.G.染色陰性而纖維素染色陽性 V.G.染色對是高血壓性血管疾患還是淀粉性樣變血管損害的鑒別也很重要。H-E染色的玻璃樣變和淀粉樣變有時很難區(qū)別，用V.G.染色和淀粉樣物質(zhì)染色則可作出區(qū)別。如高血壓性腎固縮其小動脈壁V染色呈紅色。而淀粉樣物質(zhì)沉積的小動脈壁V.G.染色呈黃色。 |
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