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專業(yè): 生物化學

[交流] 聊聊｜關于RAPID技術中引物探針的設計和那些BUG

上一期我們介紹了什么是RAPID，RAPID的原理、技術特點以及應用范圍，今天再來聊聊RAPID引物探針的設計原則要點以及其中可能會遇到哪些BUG？

做分子檢測的朋友們對PCR技術應該都是非常熟悉了，在PCR中，引物的設計都已經(jīng)有一套成型的protocol，按照這個protocol來進行引物設計，一般都能得到想要的結果。即使結果與預期有差距，通過改變反應條件，如更改退火溫度，調整延伸時間等，都可以在不改變引物的條件下，達到預期目的。因此，做PCR的小伙伴們，都可以根據(jù)文獻中報道的引物，很輕松的就能按照文獻中的protocol，達到想要的結果。

那么RAPID的引物、探針設計原則及要點有哪些：

設計原則

1.引物長度一般在30-35nt之間，可以大于35nt，不要小于30nt；

2.擴增子最好不超過500bp，一般在100-300bp之間；

3.如要進行探針檢測，設計時須注意為探針留出足夠的序列空間，探針長度不低于45nt；

4.探針修飾不是中間插入dSPacer，而是將一個堿基替換為dSPacer；

5.一般在設計引物探針時，盡量避免重復序列，一般不要超過3個；

6.先設計探針，再設計引物，更符合經(jīng)濟效益原則。

設計要點

1.5’端(3-5nt)序列應避免出現(xiàn)重復的G;

2.3’端(后3nt)序列最好有G或C；

3.GC含量在40-60%之間；

4.TM值對引物影響不是太大，不是關鍵因素；

5.避免引物內、引物間出現(xiàn)結構。

另外，

PCR 引物可以用于 RAPID，具有 PCR常用長度(例如18-23bp)的引物可用于RAPID反應。不過反應可能會稍慢，如果想要快速擴增，還是建議使用稍微長一些的引物。

而大部分利用聚合酶的 5'-3'核酸酶活性的PCR探針不能用于 RAPID。

有些小伙伴會發(fā)現(xiàn)，在PCR中運行很好的策略，在做重組酶聚合酶擴增（RPA）/RAPID的實驗中不管用，或者說是效果差，這到底是怎么回事呢？

除了上面說的原則以外，還需要注意以下幾點：

01

在PCR實驗中，控制反應條件的因素，主要是溫度因素，通過優(yōu)化不同反應階段的溫度，來達到實驗預期目的。而在RPA/RAPID實驗中，反應溫度（一般為37℃）是固定的，反應體系一般也是整合好的，唯一能改變的條件就是引物。

02

雖然目前PCR儀器廠家很多，但對于溫度這一物理因素，都是可以做到統(tǒng)一控制的，因此，即使使用不同的PCR儀器，設置相同的條件，都是可以達到相同的效果。目前生產(chǎn)重組酶聚合酶擴增試劑盒的廠家目前也有很多，但由于重組酶聚合酶擴增試劑盒是由多個酶參與的復合酶體系，其相對復雜，而這些體系的配比都屬于各個廠家的核心機密，因此不同廠家之間無法做到統(tǒng)一。

因此，

如果用做PCR的思維方式來做RPA / RAPID，就會發(fā)現(xiàn)，在設計了一對引物后，往往達不到預期效果。

于是，有的小伙伴為了快速出成果，就想到一種“捷徑”，購買市面上多個廠商的重組酶聚合酶擴增試劑盒，通過使用固定引物來測試不同廠家的試劑效率。這樣會導致這樣一種后果，不同的項目，不同的重組酶聚合酶擴增試劑盒效果也不一樣，在實際操作中很容易用混亂，不利于管理工作。

這種通過固定引物，來篩選重組酶聚合酶擴增體系的方法，看似是“捷徑”，實際上要購買大量不同廠商試劑，每個項目都需要進行各種比較，浪費了大量的物力財力，是不劃算的。

那么應該怎么做呢？

首先在RPA / RAPID體系中，進行引物篩選，進行引物篩選，進行引物篩選，重要的事情說三遍。

將反應體系固定，設計不同的引物對，通過對引物的篩選，得到達到預期的引物，這樣看似復雜，實際上是最快捷的方式。一般在篩選9對引物，基本上都能得到達到預期效果的引物組合，這個篩選過程，一般一天就能完成。

這樣就導致另一個問題：

有些小伙伴使用某一個廠家生產(chǎn)的重組酶聚合酶擴增試劑盒，篩選出一對較好引物。在靈敏度、特異性等方面的評價均較高，但基于多方面綜合考慮，仍然想使用樂尚的RAPID試劑，可不想再篩選引物，那又該怎么辦呢？

別著急，如果之前使用樂尚生物的RAPID試劑盒篩選出引物的小伙伴，樂尚生物將為您繼續(xù)提供高質量穩(wěn)定的RAPID試劑盒；如果是使用其他廠商試劑盒篩選出來的引物，樂尚將會提供特殊定制的不同反應體系，來達到您之前同樣的實驗效果。

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