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醫(yī)學(xué)生物科研銅蟲(chóng) (小有名氣)
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【實(shí)驗(yàn)外包】核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)
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核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)(Ribonuclease protection assay.RPA)基本原理是將標(biāo)記的特異RNA探針(32P或生物素)與待測(cè)的RNA樣品液相雜交標(biāo)記的特異RNA探針按堿基互補(bǔ)的原則與目的基因特異性結(jié)合.形成雙鏈 RNA:未結(jié)合的單鏈RNA經(jīng)RNA酶A或RNA酶T1消化形成真核糖核酸.而待測(cè)目的基因與特異RNA探針結(jié)合后形成雙鏈RNA 免受RNA酶的消化。對(duì)于32P標(biāo)記的探針雜交雙鏈進(jìn)行變性聚丙酰胺凝膠電泳,用放射自顯影或磷屏成像系統(tǒng)檢測(cè)被保護(hù)的探針的信號(hào):對(duì)于生物素標(biāo)記的探針.雜交雙鏈經(jīng)過(guò)變性聚丙酰胺凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至尼龍膜 采用鏈富親和素-辣根過(guò)氧化物酶(Streptavidin-HRP)和化學(xué)發(fā)光底物與膜上biotin標(biāo)記的探針結(jié)合X射線(xiàn)膠片或化學(xué)發(fā)光圖像分析儀檢測(cè)雜交信號(hào)， 與Northem雜交相比.核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)靈敏度更高:由于沒(méi)有PCR擴(kuò)增的步。避免了PCR擴(kuò)增造成的偏移 可以更準(zhǔn)確的反應(yīng)RNA的豐度 在一個(gè)反應(yīng)體系中可以同時(shí)檢則多個(gè)指標(biāo) 完整的RPA實(shí)驗(yàn)包括探針的制備/標(biāo)記、雜交、RNaseA消化、變性聚丙酰胺膠電泳和信號(hào)檢測(cè)等步 驟。具體操作如下 一、探針的制備/標(biāo)記 探針的制備一般使用體外轉(zhuǎn)錄的方法進(jìn)行。 1.載體構(gòu)建及PCR 構(gòu)建含有探針序列的質(zhì)粒。 設(shè)計(jì)含有17或SP6啟動(dòng)子的PCR引物注意  CR產(chǎn)物是探針的模板.所以啟動(dòng)子序列在下游引物中。2.體外轉(zhuǎn)錄 利用體外轉(zhuǎn)錄體系以PCR產(chǎn)物為模板合成探針。常用的體外轉(zhuǎn)錄體系如下 4 ul 5倍轉(zhuǎn)錄緩沖液2ul 0.1 M DTT 4 ul 2.5 mM NTP(A.C.G) 0.8 ul RNA酶抑制劑(25 U/ pl)(Promega)100 pM 標(biāo)記UTP(32P) 1 ul RNA聚合酶SP6.T7或T3 總體積 20 ul。孵育1小時(shí)37℃。 二、雜交 1.探針純化 可以使用QIAGEN公司的QIAquick核苷酸去除試劑盒或Boehringer離心柱(G50葡聚糖凝膠)進(jìn)行。 2.雜交 RNA提取后溶于雜交緩沖液調(diào)整濃度為1ug/uL.8pL RNA中加入2uL探針.95C變性5分鐘.40-55℃孵育4小時(shí)(孵育溫度根據(jù)探針的溶解溫度確定)。 3.消化 1)加入RNAse消化液.37℃保溫30分鐘 2)加入10%的SDS10puL蛋白酶K(10ug/uL)20pL37℃保溫10分鐘。 3)苯酚-氯仿抽提,取上清。 4)異丙醇或無(wú)水乙醇沉淀RNA。 5)洗滌、溶解沉淀。 三、聚丙酰胺凝膠電泳 電泳方法同常規(guī)的SDS-PAGE電泳。 四、檢測(cè) 放射自顯影檢測(cè)。 注:探針也可采用非放射性標(biāo)記(如:生物素標(biāo)記),那么隨后的檢測(cè)也需要按照非放射性標(biāo)記的流程進(jìn)行。 探針 方法一方法二方法三 在一個(gè)反應(yīng)體系中使用了6種探針,3種不同的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),每一種方法重復(fù)3次(Tam Thuan NguyenJeffrey B Smith.2002) 。 |
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