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醫(yī)學生物科研銅蟲 (小有名氣)
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[交流]
【實驗技術】熒光原位雜交fish
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原位雜交是指將特定標記的已知順序核酸為探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交,從而對特定核酸順序進行精確定量定位的過程。原位雜交可以在細胞標本或組織標本上進行。 原位雜交是在研究DNA分子復制原理的基礎上發(fā)展起來的一種技術。其基本原理是兩條核苷酸單鏈片段,在適宜的條件下,能過氫鍵結合,形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 雙鍵分子的特點,應用帶有標記的(有放射性同位素,如3H、35S、32P、熒光素生物素、地高辛等非放射性物質)DNA或RNA片段作為核酸探針,與組織切片或細胞內待測核酸(RNA或DNA)片段進行雜交,然后可用放射自顯影等方法予以顯示,在光鏡或電鏡下觀察目的 mRNA或DNA 的存在并定位;用原位雜交技術,可在原位研究細胞合成某種多肽或蛋白質的基因表達。此方法有很高的敏感性和特異性,可進一步從分子水平來探討細胞的功能表達及其調節(jié)機制。已成為當今細胞生物學、分子生物學研究的重要手段。 以菌落原位雜交為例 對分散在若干個瓊脂平板上的少數菌落(100-200)進行克隆篩選時,可采用該方法。將這些菌落歸并到一個瓊脂主平板以及已置于第二個瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素濾膜上。經培養(yǎng)一段時間后,對菌落進行原位裂解。主平板應貯存于4℃直至得到篩選結果。 將少數菌落轉移到硝酸纖維素濾膜上 (1) 在含有選擇性抗生素的瓊脂平板上放一張硝酸纖維素濾膜。 (2) 用無菌牙簽將各個菌落先轉移至濾膜上,再轉移至含有選擇性抗生素但未放濾膜的瓊脂主平板上。應按一定的格子進行劃線接種(或打點)。每菌落應分別劃線于兩個平板的相同位置上。最后,在濾膜和主平板上同時劃一個含有非重組質粒(如pBR322)的菌落。 (3) 倒置平板,于37℃培養(yǎng)至劃線的細菌菌落生長到0.5-1.0mm的寬度。 (4) 用已裝防水黑色繪圖墨水的注射器針頭穿透濾膜直至瓊脂,在3個以上的不對稱位置作標記。在主平板大致相同的位置上也作上標記。 (5) 用Parafilm膜封好主平板,倒置貯放于4℃,直至獲得雜交反應的結果。 (6) 裂解細菌,按本段下面所述方法,使釋放的DNA結合于硝酸纖維素濾膜。 實驗條件: 切片機(石蠟和冰凍) |
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