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北京艾柏森鐵蟲 (小有名氣)
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[交流]
免疫組化：非特異性染色的八大原因
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免疫組化，免疫組織化學(xué)技術(shù)（immunohistochemistry），是一項利用抗原抗體反應(yīng)，通過使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原，對蛋白定位，定性的實驗技術(shù)。 非特異性染色的八大原因 然而，結(jié)果卻未必都是那么如意的，常常出現(xiàn)下面這種狀況，好好的一張片子染得臟臟的，這就是最常見的非特異性染色。 1. 抗體問題，真的是一分錢一分貨��！ 一抗用多克隆抗體容易出現(xiàn)非特異性染色，建議用高純度，高效價的針對更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來解決。單克隆抗體很貴，不過結(jié)果真的很好。尤其是背景非特異性染色不會太深。真是一分價錢一分貨。一抗過期也會造成杯具，所以要注意抗體的有效期。 2. 抗體濃度過高/孵育時間過長 一抗?jié)舛忍咭彩浅霈F(xiàn)非特異性染色的常見原因。解決的辦法就是預(yù)實驗。每次使用新抗體前應(yīng)該多做預(yù)實驗，摸索出zui理想的工作濃度，不能簡單地按照說明書來用。另一個常見原因就是孵育時間過長。解決的辦法就是定時器。加上抗體后，立刻調(diào)好定時器，提醒自己及時終止反應(yīng)，就會避免這個問題。 3. dab染色時間太長/變質(zhì) dab的孵育時間過長，會造成背景非特異性染色。dab的顯色時間不是一成不變的，主要靠自己在顯微鏡下盯著，一旦出現(xiàn)淺淺的棕色的時候，就要馬上沖洗。出現(xiàn)棕色的時間過短，表明抗體濃度過高；出現(xiàn)棕色的時間過長，表明抗體濃度過低。dab要保存于避光干燥的地方，現(xiàn)用現(xiàn)配，臨用前才加入h2o2。圖1就沖洗的有些晚了；圖2就是剛剛好，染色效果棒棒噠! 4. 內(nèi)源性酶和生物素 內(nèi)源性酶和生物素也會造成非特異性染色，特別是一些內(nèi)源性酶生物素含量豐富的組織，如肝臟，腎臟，脾臟等。處理的辦法為：滅活堿性磷酸酶：zui常用的方法是將左旋咪唑（24 mg/ml）加入底物液中，并保持ph值在7.6-8.2，即能除去大部分內(nèi)源性堿性磷酸酶；對于酸性磷酸酶，可以用50 mmol/l的酒石酸抑制；對于內(nèi)源性過氧化物酶，可以用0.9%的雙氧水來滅活。對于內(nèi)源性生物素，染色前將切片浸于25 μg/ml親和素溶液中15分鐘，pbs清洗15分鐘后即可染色。也可以24 mg/ml的卵白素封片15分鐘。 5. 組織變干 一下子染太多片子的時候，容易出現(xiàn)這種情況。解決的辦法就是不要貪多嚼不爛。一次少染幾張。還有就是試劑充分覆蓋組織，超出組織邊緣2 mm。然后用pap筆在組織周圍畫一個圈圈，把修復(fù)液圈在里面。避免修復(fù)液流走。圈圈應(yīng)該距離組織邊緣3-4 mm。 6. 浸泡時間過長 切片在緩沖液或修復(fù)液里面浸泡過夜，也會引起杯具。這都是偷懶的做法。但是有時候也是可以偷一下懶的。毛博的獨門秘技就是4°c冰箱。只要把容器放在4°c冰箱里，過夜完全沒有問題。 7. 清洗不充分 清洗一定要充分。pbs液一定要雙蒸水新配，用之前再次測ph值。緩沖液用0.05 mol/l的tris-hcl，0.15 mol/l的nacl即可。如果加一點去垢劑tween-20就更好了。 8. 封閉血清問題 是否選擇了正確的封閉血清。原則是選擇二抗動物的非免疫血清，例如二抗是羊抗兔，就要選擇非免疫羊血清。用pbs稀釋為3-10%的溶液孵育切片，37°c 10-30分鐘。這里不用洗，直接甩掉即可。毛博再貢獻一個獨門絕招，直接用奶粉也可以。用5%的脫脂奶粉就可以了。而且效果還不錯。怎么樣？簡單吧。 [ Last edited by 小冀- on 2021-11-10 at 11:09 ] |
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