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質(zhì)粒提取及原理這些你都知道嗎 已有1人參與
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DNA儲存著世代相傳的遺傳信息，被譽為“生命的密碼"。從沃森和克里克發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的那一刻起，DNA的“魔幻之盒"被打開，越來越多不同類型的DNA分子被解密。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)DNA分子呈線性結(jié)構(gòu)，例如人的染色體DNA，如果將單個體細胞中的DNA分子全部展開，長度可達2-3米。然而有一類存在于細菌中的DNA分子卻呈環(huán)狀，穿梭在浩瀚的DNA分子宇宙。雖然它的大小只有細菌染色體的千分之一，卻魔力無窮——它就是神奇的“質(zhì)粒"（plasmid）。 左：細菌染色體DNA的線性結(jié)構(gòu)；右：質(zhì)粒的環(huán)狀結(jié)構(gòu)（By User: Spaully on English wikipedia - Own work， CC BY-SA 2.5， 質(zhì)粒是染色體外能夠進行自主復(fù)制的遺傳單位，當前通常用其來特指細菌、真菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的 DNA分子。 在基因工程領(lǐng)域，質(zhì)粒常常被當做基因的載體使用。在分子生物學(xué)中，質(zhì)粒 DNA被當做基因運載工具具有非常廣泛的應(yīng)用。 在質(zhì)粒DNA的應(yīng)用過程中，其純度對于酶切、PCR擴增等實驗結(jié)果有著比較大的影響，因此需要保證質(zhì)粒DNA提取的純度和效率。 在細菌中提取質(zhì)粒DNA通常按照以下步驟進行: 第一步，培養(yǎng)細菌，使質(zhì)粒擴增; 第二步，進行細菌的收集和裂解; 第三步，質(zhì)粒 DNA的分離和純化。 在質(zhì)粒DNA的提取過程中，其提取效果和其大小呈現(xiàn)出正比例關(guān)系，越小越容易進行提取，這主要是由于，如果質(zhì)粒DNA比較大的話，其特性機會和染色體DNA比較接近，這樣想要將二者分離開來難度就會變大。 在進行質(zhì)粒DNA的分離時，適宜的條件是非常重要的，主要包括pH值、SDS濃度、時間和溶菌溫度等，在適宜的條件下質(zhì)粒DNA和染色體DNA 才能夠更好的分離開來。 細菌濃度對于質(zhì)粒 DNA的提取也是非常重要的，如果細菌的濃度比較高，那么在溶菌時，溶菌液很難和細菌液充分混合，導(dǎo)致溶菌不徹底的問題，這樣會造成質(zhì)粒的回收率比較低； 而如果細菌溶度比較低，溶菌液和菌液均分混合，會造成溶液中含有較多的蛋白質(zhì)、染色體以及菌體碎片，在這樣的情況下，沉淀時質(zhì)�；睾线@些物質(zhì)共沉，進而導(dǎo)致質(zhì)粒的回收率也會比較低。 在生物學(xué)的相關(guān)研究之中，細菌質(zhì)粒DNA的提取是比較常規(guī)的技術(shù)和操作，主要的方法有堿裂解法、煮沸法以及SDS裂解法等， 下面簡單介紹一下堿裂法提取質(zhì)粒。 原理 細菌懸浮液暴露于高pH值的強陰離子洗滌劑中，會使細胞壁破裂，染色體DNA和蛋白質(zhì)變性，將質(zhì)粒DNA釋放到上清中。盡管堿性溶劑使堿基配對完全破壞，閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雙鏈仍不會彼此分離，這因為它們在拓撲學(xué)上是相互纏繞的。 只要OH-處理的強度和時間不要太過，當pH值恢復(fù)到中性時，DNA雙鏈就會再次形成。在裂解過程中，細菌蛋白質(zhì)、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復(fù)合物，后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當用K+取代Na+時，復(fù)合物會從溶液中有效地沉淀下來，離心除去變性劑后，就可以從上清中回收復(fù)性的質(zhì)粒DNA。 在SDS存在的條件下，堿水解是一項非常靈活的技術(shù)，它對E. coli的所有菌株都適用，并且其細菌培養(yǎng)物的體積可以從1-500mL以上。 主要試劑的作用原理 氫氧化鈉的作用：在堿裂解法中，氫氧化鈉的作用原理是使細胞膜由脂雙層結(jié)構(gòu)向囊泡化轉(zhuǎn)變，從而使細胞裂解，氫氧化鈉的作用既能裂解細胞讓細胞內(nèi)含物釋放出來，又是質(zhì)粒DNA和染色體DNA得以分離的關(guān)鍵。 但是對革蘭氏陽性菌來說，提取質(zhì)粒時不能直接使用堿裂解法，而是先用溶菌酶將肽聚糖層消化，然后才用堿裂解法裂解細胞。這是因為革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌細胞壁結(jié)構(gòu)的區(qū)別及特點不同。 十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)的作用：SDS其實也是一種細胞裂解劑，其裂解細胞的能力比氫氧化鈉要弱很多。此處使用SDS是因為SDS通常用作蛋白質(zhì)的變性劑和助溶劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)。 幾乎所有的蛋白質(zhì)能溶解在SDS中，甚至包括疏水和變性的蛋白。DNA提取過程中，SDS使蛋白質(zhì)變性后與DNA分開。 5mol/L的醋酸鉀溶液的作用：醋酸鉀溶液不但可以中和之前溶液Ⅱ中的氫氧化鈉，還使得溶液的酸堿度劇烈下降，避免染色體DNA長時間暴露于強堿環(huán)境而斷裂(斷裂后就不好去除)，又使得質(zhì)粒可以復(fù)性。 此外，SDS遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀(potassium dodecylsulfate，PDS)，而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。沉淀實際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。 由于平均兩個氨基酸上結(jié)合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀。染色體DNA容易被PDS給共沉淀了。 又由于高鹽條件也會導(dǎo)致SDS形成沉淀，而5mol/L的醋酸鉀本身就是高鹽溶液。利用高鹽環(huán)境促進沉淀的原理，有時也可以利用l0mol/L醋酸銨來代替。 優(yōu)點 堿裂解法在提取質(zhì)粒時具有一箭雙雕的作用：一方面是將細胞裂解，另一方面是形成高堿性的環(huán)境，使染色體DNA和質(zhì)粒DNA變性，為下一步質(zhì)粒DNA的復(fù)性及與染色體DNA分離做準備。 鑒定 質(zhì)粒提取以后，采用瓊脂糖電泳進行質(zhì)粒DNA鑒定時，多數(shù)情況下能看到三條帶，但不是平�？吹降某菪⒕�性和開環(huán)這三條帶。 堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線性DNA，可以采用EcoRI來線性化質(zhì)粒后再進行瓊脂糖電泳，就會看到線性質(zhì)粒DNA的位置與這三條帶的位置不一樣。其實這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體（即沒有復(fù)制完全的兩個質(zhì)粒連在了一起）。 如果不小心在溶液（即NaOH和SDS）加入后過度振蕩，會有第四條帶，這條帶泳動得較慢，遠離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。非常偶然的是，有時候抽提到的質(zhì)粒會有7-10條帶，這是由于特殊的DNA序列導(dǎo)致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈數(shù)不同）所致，這里暫不深究。 |
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2樓2022-03-01 17:15:36
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