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醫(yī)學生物科研

銅蟲 (小有名氣)

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專業(yè): 實驗動物學

[交流] 【實驗外包】免疫組化操作步驟

一.固定、脫水、包埋

取組織放入4%多聚甲醛里面固定3-4小時,時間根據標本大小適當調整。
取適當大小組織放入包埋盒中,進行脫水。每個染缸液體體積約200ml,每次脫水可以裝20個包埋盒。依次進入:
75%酒精1.5小時、95%酒精1.5小時、95%酒精1小時、無水乙醇1.5小時、無水乙醇1小時、二甲苯一號0.5小時、二甲苯二號0.5小時。
打開包埋機,分別開啟冷臺,冷點,石蠟槽,組織槽進行工作。然后用鐵飯盒承裝石蠟塊并放入包埋機組織槽中加熱溶解。將脫水后的組織連同包埋盒依次放入機器組織槽中,然后再放入石蠟飯盒一號進行第二遍浸蠟,然后石蠟飯盒二號,進行三次浸蠟。
選大小符合的模具,先調整機器滴蠟的速度,不宜過快防止有氣泡。然后在模具中滴入液體石蠟,然后從飯盒二號中拿出浸后的包埋盒,打開用鑷子取出組織放入模具中。然后用包埋盒的另一半蓋住模具,再滴入少許石蠟后放到冷臺上冷卻。按上述步驟繼續(xù)包埋下一個蠟塊。
二.切片、制片

打開切片機,固定蠟塊(可提前4度冰箱預冷一下),調整刀片和蠟塊的距離。然后調整切片厚度,先粗切,看到完整的蠟片并且有組織后切換厚度,調整到自己想要切的厚度。用力均勻,右手搖動切片,左手用毛筆接片。如片子打卷,可以用毛筆按著蠟片的邊緣再緩慢切,這樣可以得到相對平整的片子。
用毛筆和鑷子將片子或者帶狀片子托起,放入水槽中展片,水溫在40度左右。然后用防脫片載玻片輕輕撈起,載玻片的邊緣盡量不要觸碰水槽底部,防止底部氣泡上浮殘留在片子上。然后標注切片編號放到烤片機上烤片30分鐘。
三.組織化學染色

室溫脫蠟、水化:二甲苯一號10分鐘、二甲苯二號8分鐘、二甲苯三號8分鐘、無水乙醇5分鐘、90%乙醇3分鐘、80%乙醇3分鐘、70%乙醇3分鐘。蒸餾水3分鐘*3次,PBS3分鐘*3次。
熱抗原修復,換新的切片架,放入水化后的切片。配置抗原修復液(一包檸檬酸鈉粉末配置2升PBS溶液),用鐵飯盒或者鍋加熱煮沸。溫度控制在96-98度。然后將切片放入熱鍋中15分鐘,最后自然冷卻室溫。PBS五分鐘*2次,蒸餾水3分鐘*2次。
免疫組化筆畫圈:取出組織,甩干水分,可用吸水紙吸干水珠。用組化筆畫圈圍住組織,圓圈完整。
滅活內源酶活性:將切片放入濕盒中,盒中加入少量蒸餾水,滴加3%過氧化氫(二抗試劑盒中A一滴或者50微升,劑量詳見二抗說明書),室溫孵育10分鐘。PBS三分鐘*3次,蒸餾水水洗三分鐘。
封閉非特異性位點:甩干水分,吸干水珠,加山羊血清封閉液(二抗試劑盒B一滴或者50微升),放入濕盒內,室溫10分鐘。
甩掉封閉液,滴加一抗蓋住組織,然后放入濕盒內4攝氏度過夜。(一抗?jié)舛纫娍贵w說明書,提前稀釋后分裝,并在負二十度冰箱保存。每張片子一抗劑量不定,看組織面積大小,xxxxx癌組織一張20微升左右。
第二天,4度冰箱取出濕盒,室溫復溫30分鐘,PBS三分鐘*三次,蒸餾水洗滌三分鐘。
甩干水分,吸干水珠,滴加二抗(二抗試劑盒C)一滴或者50微升,室溫孵育10分鐘。PBS三分鐘*三次,蒸餾水水洗三分鐘。
每張片子滴加一滴或者50微升鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液(二抗試劑盒D),室溫孵育10分鐘,PBS三分鐘*三次,蒸餾水水洗三分鐘。
每張片子滴加兩滴或者100微升DAB溶液,顯微鏡下觀察3-10分鐘。染色合適即可終止染色,自來水沖洗。
蘇木素復染,1-2分鐘,細胞核變藍色即可終止,自來水或者PBS沖洗反藍(可用0.5%氨水反藍)。
1%鹽酸酒精分化3秒,自來水沖洗三分鐘。
脫水:70%酒精1分鐘、80%酒精1分鐘、95%酒精2分鐘、無水乙醇4分鐘、二甲苯一號3分鐘、二甲苯二號3分鐘。
涼干片子后滴加適量中性樹膠封片,蓋上蓋玻片,小心氣泡。晾干半天即可。
顯微鏡下拍照。

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1樓 2021-11-05 10:03:31

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