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醫(yī)學(xué)生物科研銅蟲 (小有名氣)
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【實(shí)驗(yàn)外包】高質(zhì)量染色切片要知道 已有1人參與
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蘇木精(hematoxylin)和伊紅(eosin)染色方法簡(jiǎn)稱HE染色方法 是常規(guī)病理制片最基本的染色 能夠?qū)φ＝M織和病理組織進(jìn)行形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察。 一、實(shí)驗(yàn)原理 1、細(xì)胞核染色的原理·蘇木精為堿性天然染料 可使細(xì)胞核著色。細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)的成分主要是DNA 在 DNA的雙螺旅結(jié)構(gòu)中 兩條核苷酸鏈上的磷酸基向外.使DNA雙螺旋的外側(cè)帶負(fù)電荷.呈酸性.很容易與帶正電荷的蘇木精堿性燃料以離子鍵或氫鍵結(jié)合而被染色。蘇木精在堿性溶液中呈藍(lán)色 所以細(xì)胞核被染成藍(lán)色。 2、細(xì)胞漿染色的原理:伊紅是一種化學(xué)合成的酸性染料 在一定條件下可使細(xì)胞漿著色。細(xì)胞漿的主要成分是蛋白質(zhì).為兩性化合物,細(xì)胞漿的染色與染液的pH在胞漿蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(4.7-5.0)以下時(shí)胞漿蛋白質(zhì)以堿式電離.則細(xì)胞漿帶正電荷 就可被帶負(fù)電荷的酸性染料染色，伊紅在水中離解成帶負(fù)電荷的陰離子與胞漿蛋白質(zhì)帶正電荷的陽(yáng)離子結(jié)合使細(xì)胞漿著色 呈現(xiàn)紅色 3、分化作用:染色后用某些特定的溶液將組織過多結(jié)合的染色劑脫去這個(gè)過程稱為分化作用.所用的溶液稱為分化液。在HE染色中用0.5%鹽酸乙醇作為分化液.因酸能破壞蘇木精的醌型結(jié)構(gòu).使組織與色素分離而退色。經(jīng)蘇木精染色后.必須用0.5%鹽酸乙醇分化 使細(xì)胞核過多結(jié)合的蘇木精染料和細(xì)胞漿吸附的蘇木精染料脫去.在進(jìn)行伊紅染色 才能保證細(xì)胞核與細(xì)胞漿染色的分明。因此在HE染色中分化是極為關(guān)鍵的一步。 4、返藍(lán)作用 分化之后 蘇木精在酸性條件下處于紅色商子狀態(tài) 呈紅色 在堿性條件下處于藍(lán)色離子狀態(tài)呈藍(lán)色，組織切片經(jīng)0.5%鹽酸乙醇分化后星紅色或粉紅色 故分化之后,立即用水出去組織切片上的酸而終止分化再用弱堿性水(0.2%氨水)使蘇木精染上的細(xì)胞核星現(xiàn)藍(lán)色 這個(gè)過程稱為返藍(lán)作用或藍(lán)化作用。另外用自來水浸洗也可使細(xì)胞核返藍(lán),但所需時(shí)間較長(zhǎng)。 二、實(shí)驗(yàn)材料和試劑: 1、蘇木精染液 蘇木精染液配制方法有多種Harris蘇木精染液是最常用的一種 其配方如下 蘇木精:2g無水乙醇:20ml硫酸鋁鉀:20g蒸餾水:200ml氧化汞:0.5g冰醋酸:8ml 配制步驟:先用無水乙醇溶解蘇木精 用蒸餾水加熱溶解硫酸鋁鉀,再將這兩種液體混合后煮沸(約1min),離火后向該混合液中迅速加入氧化汞并用玻璃棒攪拌至染液變?yōu)樽霞t色(此時(shí)有大量氣泡產(chǎn)生 故容器宜大,以防液體溢出).隨即用冷水冷卻至室溫,然后加入冰醋酸并混勻.過濾后使用。 2、伊紅染液 伊紅染液有是水溶性和醇溶性兩種,常用的為0.5%水溶性伊紅染液其配方如下伊紅Y:0.5g 95%乙醇:100ml 3、0.5%鹽酸乙醇分化液36%-38%鹽酸:0.5ml75%乙醇:99.5ml 4、0.2%氨水(pH在7.5-8之間)25%-28%氨水:0.2ml蒸餾水:100ml 三、染色步驟與方法 1、烤片:60分鐘溫度60℃(目的:使組織切片與載玻片貼合的更加緊密) 2、切片脫蠟至水: (1)二甲苯I:10min(2)二甲苯Ⅱ:10min(3)二甲苯田:10min(4)無水乙醇I:3-5min (5)無水乙醇Ⅱ:3-5min(6)95%乙醇I:3-5min(7)90%乙醇:3-5min(8)80%乙醇:3-5min(9)75%乙醇:3-5min (10)蒸餾水洗:5min 3、染色 (1)木精染色:5-10min (2)蒸餾水洗.1min (3)0.5%鹽酸乙醇分化:10s/10 to 20 quick dips(4)蒸餾水洗:2min (5)0.2%氨水返藍(lán):約40s(6)蒸餾水洗:2x1min(7)0.5%伊紅染色:5min(8)蒸餾水速洗 4、脫水、透明、封固 (1)80%乙醇:3min(2)90%乙醇:3min(3)95%乙醇:3min(4) 無水乙醇I:5min(5)無水乙醇Ⅱ:5min(6)二甲苯I:5min(7)二甲苯Ⅱ:5min(8) 二甲苯Ⅲ:5min(9) 中性樹膠封固 四、染色結(jié)果 細(xì)胞核呈藍(lán)色.細(xì)胞漿呈粉紅色至桃紅色.膠原纖維呈淡粉紅色 紅細(xì)胞呈較鮮艷的橘紅色。鈣鹽、細(xì)菌菌落呈藍(lán)色或紫藍(lán)色。 五、注意事項(xiàng) 1、染色前,切片脫蠟應(yīng)徹底。若脫蠟不徹底.則影響著色。 2、染色時(shí)間與染液的新舊程度有關(guān) 不能一成不變。新配制的染液著色力較強(qiáng),染色時(shí)間可適當(dāng)縮短:反之,則適當(dāng)延長(zhǎng)。伊紅染色程度應(yīng)以蘇木精對(duì)核的著色程度為參照標(biāo)準(zhǔn),掌握其染色時(shí)間,以達(dá)到對(duì)比鮮明為宜。 3、伊紅染液的pH值不能低于細(xì)胞核染色體等電點(diǎn)(pl=3.3).否則染色體也可表現(xiàn)堿式電離帶正電荷.而被伊紅染液染色.便細(xì)胞漿與細(xì)胞核區(qū)分不開。因此伊紅染液的pH值應(yīng)小于胞漿蛋白等電點(diǎn),而大于胞核染色體等電點(diǎn)在3.6-4.7之間。 4、掌握好分化程度分化時(shí)要認(rèn)真觀察 精心操作,觀察切片由深藍(lán)色變成紅色或粉紅色時(shí),立即將切片置入自來水中終止分化。 5、封固用的中性樹膠的濃度要適宜.避免產(chǎn)生氣泡。如中性樹膠過稀 容易溢出蓋玻片的周圍.且樹膠內(nèi)的二甲苯易揮發(fā) 樹膠干燥濃縮后可產(chǎn)生氣泡。如中性樹膠過濃稠 滴后不容易擴(kuò)散.有氣泡不易排出。若封盾后氣泡存留,既影響切片觀察.又影響切片保存。因此有氣泡產(chǎn)生時(shí),應(yīng)輕輕按壓蓋玻片,將氣泡驅(qū)除。 6、脫蠟用二甲苯應(yīng)該經(jīng)常過濾并定期更換新液脫蠟時(shí)應(yīng)避免將二甲苯過多地帶入酒精中出現(xiàn)云霞現(xiàn)象。 7、為了加速脫蠟過程可將切片預(yù)先進(jìn)行加溫再行脫蠟。 8，蘇木素染色時(shí)間的長(zhǎng)短主要依據(jù)氣溫的高低 染液的新舊組織的差別以及組織所使用周定液不同而有所區(qū)別.很難提出一個(gè)確切的時(shí)間一般先染5-10min.取出后返藍(lán) 鏡下觀案.若染色不足,可延長(zhǎng)染色時(shí)間。 9、蘇木素使用一段時(shí)間后.表面易出現(xiàn)亮晶狀氧化漂浮物.必須勤過浦 否則粘附于組織上時(shí)不易去掉.蘇木素液顏色為灰藍(lán)色時(shí)應(yīng)棄掉換新液。 10、鹽酸酒精分化是蘇木素染色的關(guān)鍵 分化時(shí)間長(zhǎng)短很難確切說出只有憑經(jīng)驗(yàn)來控制操作.分化時(shí)細(xì)胞核以外成分首先脫色 其次胞核開始脫色 分化時(shí)應(yīng)隨時(shí)在顯微鏡下觀室.便組織著染適度 分化鮮明,一般在鹽酸酒精中將組織分化成淡粉色為宜。 11、分化適度的切片應(yīng)立即用水沖洗.否則殘存在切片上的鹽酸酒精仍然進(jìn)行著脫色作用,沖洗時(shí)水流不宜過大,以防脫片沖洗時(shí)間不應(yīng)少于10min。 12、為了縮短沖洗時(shí)間.可用返藍(lán)液,但必須充分水洗,否則影響伊紅的著色。13、伊紅應(yīng)該淡染,以免喧賓奪主.應(yīng)該色彩對(duì)比適當(dāng)鮮明艷麗 14、組織切片的脫水,透明等必須徹底,否則切片易呈云霧狀,難以鏡檢。脫水用酒精必須定期檢查更換以保證有效濃度。 15、切片有脫落現(xiàn)象時(shí)可用05%稀火棉膠液防止切片脫蠟至純酒精后 如火棉膠液浸半分鐘 取出稍干如80%酒精中硬化火棉膠.然后入水洗.進(jìn)行染色。 0.5%火棉膠配方純酒精90ml乙醚90ml 5%火棉膠液20ml |
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 實(shí)驗(yàn)方法 |
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