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醫(yī)學(xué)生物科研銅蟲 (小有名氣)
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[交流]
【實驗外包】教你提高RNA抽取高得率!
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我們都知道RNA提取過程中最重要的注意事項是防止RNA酶的污染導(dǎo)致實驗失敗,下面我們總結(jié)了一些實驗技巧.以幫助提取更高質(zhì)量的RNA�？偟膩碚f做培養(yǎng)細(xì)胞的RNA提取比較容易.用普通的trzol(國內(nèi)外均可)只要準(zhǔn)備充分.操作的準(zhǔn)確,這樣提高RNA抽取高得率一般是沒有什么問題的。 RNA提取失敗經(jīng)驗總結(jié) 1、環(huán)境污染影響RNA提取，皮膚攜帶的細(xì)菌霉菌等微生物及人體自然脫落下來的皮屑都可能成為 RNA酶的來源從而影響RNA的提取。因此要培養(yǎng)良好的無菌操作習(xí)慣.預(yù)防微生物污染。 2、操作時勤換手套 戴手套口罩冰上操作動作迅速。最關(guān)鍵的一步也是決定RNA質(zhì)量的一步是:離心后.出現(xiàn)分層RNA在上清中中間是DNA下面是蛋白。這里一旦不留意中間的DNA就會混入從而影響 RNA質(zhì)量。這里要提一個小技巧,為了提高RNA的質(zhì)與量,離心后不要馬上吸取含有RNA的上清液,而是移取中層的DNA和下層的蛋白。余下的下層油相(10%~15%)經(jīng)短暫高速離心之后再吸取上清含有RNA的水相。其實這一技巧可用于所有的分層液相的實驗如酚抽提DNA的實驗 回收膠中DNA的實驗。 3、對于組織而言.研磨是關(guān)鍵之一。在提取組織樣品時.就得充分研磨組織.等組織塊成為粉末后再加入Trizol試劑。常用的研磨方法是液氮研磨法，研磨后離心去處沉淀,不要在細(xì)胞離心后馬上加入Trizol試劑。因為成團(tuán)的細(xì)胞加入Trizol試劑后.外圍細(xì)胞先期施放出的大分子DNA.聚積成團(tuán),干擾成團(tuán)里層細(xì)胞的裂解.即使用加樣槍或針頭反復(fù)吸取.也無法徹底打斷已經(jīng)成團(tuán)的DNA研磨過程中有三個關(guān)鍵步驟研磨器皿高壓滅菌烘干水汽后,-80放置過夜,預(yù)冷凍組織塊的表面積盡可能大切不可成球狀，一旦用力研磨.球狀的組織塊極易飛出研缽加入足量的液氫讓組織塊完全凍透一次將組織塊研磨好。在沒有凍透之前千萬不能研磨 如一次 沒有研磨好下一次研磨的效果就差 且第二次加入的液氮會將前一次所產(chǎn)生的干粉帶出研缽,使其飛濺在研缽的四周。這一技巧同樣可用于分離提取組織塊的DNA或蛋白質(zhì)。 4、使用Trizol試劑時其中的一種成分能抑制RNA酶所有RNA樣品泡在Trizol試劑中是不可能被RNA酶消化的。但是 對樣品的后續(xù)操作會要求用無RNA酶的玻璃器用或塑料器皿。玻璃器加可以在150的烘箱中烘烤4h。塑料器血可以在0.5mo/L的NaOH中浸泡10min,用水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用 5、用0.01%的DEPC或Erasol水溶解RNA時,原則上是要根據(jù)沉淀的多少加入相應(yīng)的體積,考慮到新手一開始經(jīng)驗不足 可以少加,濃度大可以再稀釋。提取完RNA后跑電泳檢查有無DNA污染和RNA降解.然后-80保存。實驗后要注意:超凈臺需用70%乙醇擦拭 再用DEPC或Erasol除去空氣中的RNase.提取RNA所需的Tip和EP管要提前用0.1%的DEPC或Erasol水處理以除去RNase.DEPC處理還需高壓。其實RNA貯存在70%的乙醇中遠(yuǎn)遠(yuǎn)要比貯存于DEPC水中穩(wěn)定在-80可保存數(shù)年,有些甚至10多年后還可以用. 有兩種操作方式: 乙醇或異丙西沉淀后如不馬上要用.直接換成70%乙醇-80保存 用時再來分析RNA的質(zhì)是和數(shù)量常規(guī)的處理后了解RNA的質(zhì)和是 再加入3倍體積的無水乙醇 再-80保存當(dāng)然 這兩種貯存方式都要在RNA不是馬上要用的前提下進(jìn)行。如果提取的RNA比較多 可以先雀取一部分樣品進(jìn)行馬上進(jìn)行的實驗 另一部分貯存于70%乙醇,以備后用。 6、Trizo試劑提取RNA所用到的一次性試管要確保沒有破損能夠耐受12000g的離心力實驗用水相當(dāng)重要必須用DEPC處理過的無RNase水。配制過程是在去離子水中加入0.1%的 DEPC.搖過夜之后.高壓分解殘留DEPC。。提取時所有與Trizol試劑有過接觸的器血都要泡存水中吸取出來的Trizol試劑也要直接加入含有大是水的玻璃杯中 7，Trizol提取RNA時要注意戴手套和護(hù)眼罩.因為Trizo試劑含有酚等有機(jī)溶劑，操作要在通風(fēng)櫥完成避免人呼吸道吸入。同時溫度應(yīng)該控制在15-30 RNA抽提的10大竅門 1、快速組止Rnase活性。樣品收集后快速冷凍 裂解時快速操作滅活Rnase 2、選擺合適的抽提方法。高核酵含量的絕織 脂肪組織愚好用含苯酚的方法 3、預(yù)判質(zhì)量要求。Northern.cDNA文庫構(gòu)建對完整性要求高.RT PCR.RPA(Ribonucleaseprotectionassav)對完整性要求不是很高。RT-PCR對純度(酵抑制物殘留)要求很高。 4、徹底勻漿是提高得率和降低降解的關(guān)鍵 5、檢查RNA的完整性，電泳28S:18S=2:1是完整的標(biāo)志.1:1對大部分實驗也是可以接受的 6、去除DNA。用于RT-PCR.arrayanalysis最好用Dnase|去除DNA。 7、降低外源酶的污染，不能從外面又導(dǎo)入酶。 8、低濃度的核酸濃縮時.要加入助沉淀試劑。但要防止助沉淀劑含酶及DNA污染。 9、徹底溶解RNA 必要時可以65℃加熱5分鐘。 10、合話的保存方法，短時間可以-20C保存長期請保存于-80°C 提高RNA得率的方法 1、使用更有效的破碎/勻漿方法。RNA如果不能被有效釋放出來,得率是會降低的。液氣搗碎、酵消化破壁(Lysozyme/Lyticase)、電動勻漿器勻漿,雖然麻煩,但都是獲得高得率的有效手段 2、抽提試劑的更換。假如得率低不是由勻漿方法不徹底引起.則可能是所使用的試劑的裂解能力差導(dǎo)致。最合理的做法是:使用更多的裂解液 用完后換廠家。另外 可以改用不使用苯酚、氯仿提取的試劑方法:使用苯酚、氛仿抽提的方法由于不可能全部取出上清.RNA的損失是比較大的 3、延長沉淀時間。如果核酸濃度低.采取低溫沉淀、并延長沉淀時間.可以獲得非常好的效果。RNA提取過程中最應(yīng)該注意的就是RNA酶的防止 所有操作在超凈臺完成 然后一定要帶一次性手套,而且一直要換。按規(guī)程操作提高RNA高得率不是問題 |
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