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醫(yī)學(xué)生物科研銅蟲 (小有名氣)
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【實(shí)驗(yàn)外包】一文讓你讀懂DNA甲基化!
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一、DNA甲基化原理 DNA甲基化(methylation)是一種表觀遺傳修飾.它是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyl-transferase.DNMT)催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)作為甲基供體,將DNA的CG兩個(gè)核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基主要形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)(常見于基因的5-CG-3'序列)和少量的N6-甲基嘌呤(N6-mA)及7-甲基鳥嘌呤(7-mG)結(jié)構(gòu)基因含有很多CpG 結(jié)構(gòu).2CpG 和2GPC 中兩個(gè)胞嘧啶的5位碳原子通堂被甲基化，目?jī)蓚�(gè)甲基集團(tuán)在DNA 雙鏈大溝中旱特定三維結(jié)構(gòu)，基因組中60%~90%的CpG都被甲基化.未甲基化的CpG成簇地組成CpG島位干結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的核心序列和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。DNA 甲基化可引起基因組中相應(yīng)區(qū)域染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化使DNA 失去核酶0限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)以及DNA酶的敏感位點(diǎn)使染色質(zhì)高度螺旅化 凝縮成團(tuán).失去轉(zhuǎn)錄活性。5位C甲基化的胞嘧啶脫氨基生成胸腺嘧啶.由此可能導(dǎo)致基因置換突變,發(fā)生堿基錯(cuò)配:T2G.如果在細(xì)胞分烈過程中不被糾正.就會(huì)誘發(fā)遺傳病或癌癥 而且生物體甲基化的方式是穩(wěn)定的.可遺傳的。 在真核生物DNA中5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化學(xué)性修飾堿基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位點(diǎn),它在基因組中呈不均勻分布.存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的區(qū)域在哺乳動(dòng)物中mC約占C總量的2-7%。 DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式.能在不改變DNA序列的前提下,改變遺傳表現(xiàn)。為外遺傳編碼(epigenetic code)的一部分.是一種外遺傳機(jī)制。DNA甲基化過程會(huì)使甲基添加到DNA分子上.例如在胞嘧啶環(huán)的5碳上這種5'方向的DNA甲基化方式可見於所有脊椎動(dòng)物。在人類細(xì)胞內(nèi).大約有1%的DNA堿基受到了甲基化。在成熟體細(xì)胞組織中.DNA甲基化一般發(fā)生于CpG雙核苷酸(CpG dinucleotide)部位而非CpG甲基化則于胚胎干細(xì)胞中較為常見。植物體內(nèi)胞嘧啶的甲基化則可分為對(duì)稱的CpG(或CpNpG)或是不對(duì)稱的CpNpNo形式(C與G是堿基:p是磷酸根:N指的是任意的核苷酸)。特定胞吃碇受甲基化的情形 可利用亞硫酸鹽定序(bisulfite sequencing)方式測(cè)定。DNA甲基化可能使基因沉默化.進(jìn)而使其失去功能。此外,也有一些生物體內(nèi)不存在DNA甲基化作用。 二、DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶分類.DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶有兩種: (1)DNM T1.持續(xù)性DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶-作用于僅有一條鏈甲基化的DNA 雙鏈.使其完全甲基化.可參與 DNA復(fù)制雙鏈中的新合成鏈的甲基化.DNMT1可能直接與HDAC(組蛋白去乙�；D(zhuǎn)移酶)聯(lián)合作用阻斷轉(zhuǎn)錄 (2)DNM T3a，DNM T3b從頭甲基轉(zhuǎn)移酶它們可甲基化CpG.使其半甲基化繼而全甲基化。從頭甲基轉(zhuǎn)移酶可能參與細(xì)胞牛長(zhǎng)分化調(diào)控 其中DNM T3b在腫瘤基慶甲基化中起重要作用。 DNA去甲基化有兩種方式: (1)被動(dòng)途徑:由于核因子NF粘附甲基化的DNA.使粘附點(diǎn)附近的DNA不能被完全甲基化,從而阻斷DNM T1的作用  2)主動(dòng)途徑:是由去甲基酶的作用將甲基集團(tuán)移去的過程。在DNA 甲基化阻遏基因表達(dá)的過程中,甲基化CpG 粘附蛋白起著重要作用。雖然甲基化DNA可直接作用干甲基化敏感轉(zhuǎn)錄因子E2F、CREB、AP2、CM ycoM yn、NF2KB、Cmyb、Ets,使它們失去結(jié)合DNA的功能從而阻斷轉(zhuǎn)錄,但是,甲基化CpG 粘附分子可作用于甲基化非敏感錄因子(SP1、CTF、YY1)使它們失活.從而阻斷轉(zhuǎn)錄。人們已發(fā)現(xiàn)5 種帶有恒定的甲基化DNA結(jié)合域(MBD)的甲基化CpG 粘附蛋白，其中M ECP2、MBD1、MBD2、MBD3參與甲基化有關(guān)的轉(zhuǎn)錄陽遏:MBD1有糖基轉(zhuǎn)移酶活性.可將T從錯(cuò)配堿基對(duì)ToG中移去.MBD4基因的突變還與線粒體不穩(wěn)定的腫瘤發(fā)生有關(guān)。在MBD2缺陷的小泉細(xì)胞中.不含M ECP1復(fù)合物.不能有效阻止甲基化基因的表達(dá)。這表明甲基化CpG 粘附蛋白在DNA 甲基化方式的選擇.以及DNA 甲基化與組蛋白去乙�；�、染色質(zhì)重組相互聯(lián)系中的有重要作用。三、DNA甲基化檢測(cè)方法:BSP 1、甲基化檢測(cè)方法原理 亞硫酸氫鈉外理后測(cè)席法(bisulfite genomic sequencing PCR.BSP)是利用未甲基化的胞嘧啶可以被亞硫酸氫鈉發(fā)生脫氨基變?yōu)槟蜞奏さ脑?用兩一特異性引物擴(kuò)增后測(cè)序。測(cè)序法克服了只能針對(duì)單個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)并目這些位點(diǎn)必須是限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的缺點(diǎn) 可以對(duì)任何基因序列的甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。 2、甲基化檢測(cè)方法具體實(shí)驗(yàn)步驟: 第一部分 基因組DNA的提取 這一步可以購(gòu)買供細(xì)胞或組織使用的DNA提取試劑盒如果實(shí)驗(yàn)室條件成熟 自己配試劑提取完全可以。 DNA比較穩(wěn)定只要在操作中不要使用暴力提出的基因組DNA應(yīng)該是完整的。此步重點(diǎn)在于DNA的純度.即減少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取過程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除兩者。 使用兩者的細(xì)節(jié) 1、蛋白酶K可以使用滅菌雙蒸水配制成20mg/ml 2、RNA酶必須要配制成不含DNA酶的RNA酶,即在購(gòu)買市售RNA酶后進(jìn)行再處理 配制成10mg/ml。否則可能的后果是不僅沒有RNA.連DNA也被消化了。兩者均于-20度保存。 驗(yàn)證提取DNA的純度的方法有二:1:紫外分光光度計(jì)計(jì)算OD比值 2:1%-1.5%的瓊脂糖疑膠電泳。 建議瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè):瓊脂糖凝膠電泳完全可以明確所提基因組DNA的純度,并根據(jù)Marker的上樣是估計(jì)其濃度,以用于下一步的修飾。 第二部分 亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA 雙蒸水(DDW)經(jīng)高壓蒸汽滅菌。 1、將約2ugDNA于1.5mIEP管中使用DDW稀釋至50ul 2、加5.5ul新鮮配制的3M NaOH 3、42℃水浴30min水浴期間配制: 4、10mM對(duì)苯二酚(氫醒).加30ul至上述水浴后混合液中 溶液變成淡黃色)5、3.6M亞硫酸氫鈉(Sigma.S9000),配制方法:1.88g亞硫酸氫鈉使用DDW稀釋,并以3M NaOH滴定溶液至PH5.0,最終體積為5ml。這么大濃度的亞硫酸氫鈉很難溶,但加入NaOH后會(huì)慢慢溶解,需要有耐心。PH一定要準(zhǔn)確為5.0。加520ul至上述水浴后溶液中 6、EP管外裹以鋁箔紙.避光.輕柔顛倒混勻溶液 7、加200 ul 石蠟油,防止水分蒸發(fā),限制氧化。 8、50℃避光水浴16h。注意: (1)基因組DNA的量不需十分精確.寧多勿少,因?yàn)樵谝院蠹兓厥詹襟E中會(huì)有丟失,且此方法修飾最多可至4ug。 (2)所有試劑均須新鮮配制,所以配液的技術(shù)要過關(guān),既要快,又要精確 (3)亞硫酸氫鈉溶液呈強(qiáng)酸性,一定用堿將PH調(diào)制5.0,否則PH不合適會(huì)影響后續(xù)純化吸收。 (4)水浴最好達(dá)16小時(shí),雖可以短至8小時(shí),但后者修飾會(huì)有不完全。 第三部分修飾后DNA純化回收 EP管為高壓蒸汽滅菌的。 1、將移液器槍頭伸入石蠟油層下.先輕輕加壓使其中一小段石蠟油排出.然后吸取混合液至一潔凈 1.5mlEP管中， 2、按照試劑盒操作要求進(jìn)行修飾后DNA純化回收 第四部分修飾后DNA用于PCR 按照正常PCR操作進(jìn)行即可.但需注意以下幾點(diǎn) 1、引物問題:如果時(shí)間充裕、做的又是比較新的基因.文獻(xiàn)不多,自己設(shè)計(jì)引物。如果時(shí)間緊迫.可以選擇參考文獻(xiàn)。首先查閱SCI分值高的文獻(xiàn),然后是著名實(shí)驗(yàn)室的文獻(xiàn).如果國(guó)內(nèi)有做的,可以直接聯(lián)系咨詢。查到序列后.一定要和Genbank中的序列進(jìn)行比對(duì).防止有印刷錯(cuò)誤造成的個(gè)別堿基的差別。然后再搜一下.看用的人多否.體系條件是否一樣。用的人多、體系條件一樣,表明可重復(fù)性比較強(qiáng)。 2:Taq酶問題:體系正確、變性退火等條件合話一般的熱啟動(dòng)酶就可以。 3  CR的條件:變性一般都選擇95度,3min，其余根據(jù)文獻(xiàn).退火可以根據(jù)你的引物的退火溫度在小范圍內(nèi)嘗試。一般和文獻(xiàn)報(bào)道差別不大。只是擴(kuò)增片斷特異性的問題。建議根據(jù)文獻(xiàn)4:做PCR的EP管最好選擇進(jìn)口的.壁薄月厚度均勻.這可以保證溫度的迅速變化可以及時(shí)傳遞給管內(nèi)的反應(yīng)液.使體系真正在所設(shè)定的溫度下運(yùn)行 5 CR儀如果在某一個(gè)儀器上作出來了.最好一直用此儀器繼續(xù)，不同的儀器“脾氣"也不一樣,但EP管必要和儀器內(nèi)的插孔緊密結(jié)合方好.留有空隙會(huì)影響溫度的傳遞第五部分 PCR產(chǎn)物的凝膠回收可以使用凝膠PCR產(chǎn)物回收試劑盒.把切下來的膠按說明書操作即可。 幾個(gè)細(xì)節(jié): 1、PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳要使用新配的電泳液。凝膠濃度1%-2%均可， 2、凝膠DNA回收時(shí)在300nm紫外燈下觀察條帶位置,切取目的片斷所在位置的凝膠,盡量小,保證特異性。 3、紫外照射時(shí)間不能過長(zhǎng).否則對(duì)DNA有損傷， 4、回收后的DNA如不馬上用就儲(chǔ)存于-20度在數(shù)月內(nèi)是很穩(wěn)定的。 第六部分 PCR產(chǎn)物與T載體的連接和轉(zhuǎn)化、藍(lán)白斑篩選 1、連接T載體(Promega的試劑盒) 15ul體系:T-easy 1ul;Ligase 1ul;2xbuffer 7.5ul;DNA 5.5ul,4度,過夜。 2、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 1)-70度冰箱內(nèi)取出感受態(tài)細(xì)菌,融化后置于冰上2)連接產(chǎn)物15ul 全部加入至于冰上30分鐘3)42度,90秒鐘4)冰上2分鐘， 5)800ul LB培養(yǎng)基 6)280rpm,37度,搖床45分鐘 7)8000rpm.1分鐘在超凈臺(tái)內(nèi)去上清留100-150ul 8)涂板:37度孵箱過夜 板為含有氨芐青窯素的固體LB培養(yǎng)基)先涂:X-gar 35ul、IPTG 25ul后涂:混懸液過夜后可見板上長(zhǎng)出很多藍(lán)色或白色斑點(diǎn)取白色斑點(diǎn),尤其是藍(lán)色斑點(diǎn)周圍的白色斑點(diǎn),此處自聯(lián)率較低。3、取白斑.劃種于新板上 新板:先涂:X-gar 35ul、IPTG 25ul然后于板底劃出分區(qū).進(jìn)行標(biāo)記。根據(jù)需要一般一板作50個(gè)克隆沒有問題針頭挑白斑劃2道于板上相應(yīng)區(qū)域內(nèi)。37度,孵箱過夜。 4、聯(lián)系測(cè)序公司送測(cè)序。 這一部分的細(xì)節(jié): 1:涂板要均勻,保證Xgar和IPTG均勻分布在板面上 2:不要讓藍(lán)白斑長(zhǎng)得太滿,否則選取克隆時(shí)容易一下挑2個(gè)。 |
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