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醫(yī)學(xué)生物科研銅蟲 (小有名氣)
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【實(shí)驗(yàn)外包】流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟中Th17陽性細(xì)胞占比
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常規(guī)Th17是指T輔助細(xì)胞在各種生理與病理?xiàng)l件下分化為Th17的能力。靜息狀態(tài)下.Th0分化為Th17的能力非常弱所以外周血中極少含有Th17細(xì)胞.但是當(dāng)Th0細(xì)胞受到外界因素(如刺激素.病原體等)刺激時(shí),其中 Th0可以向Th17分化.具體分化趨向取決于細(xì)胞因子的種類。其實(shí)我們檢測(cè)到的Th17實(shí)際上是檢測(cè)Th細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)能力。 一、刺激劑 實(shí)驗(yàn)中通常選用的刺激劑為PMA(佛波酯)+lonomycin(離子霉素)。 PMA為PKC(蛋白激酶C)的激活物,PKC則可激活下游眾多的蛋白激酶的磷酸化.形成級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致許多蛋白的表達(dá).進(jìn)而引起T細(xì)胞的活化。lonomycin是Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)劑.可將細(xì)胞器內(nèi)的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿內(nèi)在細(xì)胞內(nèi)。 PKC可被DAG(二脂酰甘油)和Ca++的共同作用而激活.因此在lonomycin的參與下,T細(xì)胞內(nèi)PKC可被進(jìn)一步激活。可見PMA與lonomycin協(xié)同活化T細(xì)胞。二、高爾基體內(nèi)陷流式細(xì)胞術(shù)僅能檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的抗原.但是活化的T細(xì)胞會(huì)將多種細(xì)胞因子分泌至細(xì)胞外,因此我們還需要阻斷細(xì)胞因子分泌至細(xì)胞外。 高爾基體(Golgi)是細(xì)胞分泌的核心細(xì)胞器,各種細(xì)胞因子或蛋白合成后必須經(jīng)過高爾基體的加工、轉(zhuǎn)運(yùn)以及生物膜系統(tǒng)的不停融合交換才能分泌到細(xì)胞外.因此只要將高爾基體破壞即可組織細(xì)胞因子或蛋白分泌到細(xì)胞外。我們常選用的高爾基體阻斷劑為BFA或Monensin,其中Monensin的阻斷效果略差于BFA.但由于前者價(jià)格較昂貴.現(xiàn)實(shí)驗(yàn)中多用Monensin來替代BFA。 三、CD4內(nèi)吞 CD3+CD4+是Th細(xì)胞的表面標(biāo)志物但是當(dāng)用PMA刺激4-6小時(shí)時(shí).CD4+的細(xì)胞明顯減少,其至消失.這是因?yàn)镻MA會(huì)誘發(fā)細(xì)胞表面CD4分子被內(nèi)吞。此時(shí)我們選用用CD3和CD8反設(shè)CD4細(xì)胞,即CD3+CD8-的細(xì)胞被認(rèn)為是CD3+CD4+的細(xì)胞。值得注意的是.CD4內(nèi)吞現(xiàn)象出現(xiàn)在人源細(xì)胞中對(duì)干小鼠細(xì)胞 再進(jìn)行PMA刺激時(shí)對(duì)CD4幾乎沒有影響,因此檢測(cè)小鼠Th17時(shí)可直接用CD4設(shè)門。 五、實(shí)驗(yàn)步驟 1、單細(xì)胞縣液制備:將脾臟組織置干鐵質(zhì)濾網(wǎng)均勻研磨至脾臟細(xì)胞充分脫落用PBS將濾網(wǎng)上粘連的脾臟細(xì)胞進(jìn)行沖洗,收集洗脫下來的脾臟細(xì)胞。將小鼠腿骨進(jìn)行清理,清除肌肉組織,僅留腿骨。用剪刀將小鼠腿骨兩端進(jìn)行剪切用注射器吸取PBS對(duì)小鼠腿骨進(jìn)行沖洗,直至將骨內(nèi)髓質(zhì)完全洗脫為止。將洗脫的髓質(zhì)均勻研磨.用濾網(wǎng)進(jìn)行過濾 收集洗脫下來的骨髓細(xì)胞。 2、將制備的單細(xì)胞懸液500 g離心5 min,去上清.取沉淀。 3將細(xì)胞沉淀用2 mL溶而素進(jìn)行重顯室溫反應(yīng)10 min將紅細(xì)胞進(jìn)行裂解， 4、500 g離心5 min.去上清.取沉淀。 5、加入2 mLPBS 將細(xì)胞沉淀進(jìn)行洗滌 重縣后 500 g離心5 min.去上清.取沉淀 6、用1 mL RPMI培養(yǎng)基.吹打混勻重懸細(xì)胞。 7、細(xì)胞按1:10或1:20倍稀釋.進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。 8、取5*106個(gè)淋巴細(xì)胞進(jìn)行刺激.加入PMA、lonomycin和Golgistop.37C培養(yǎng)4h 9、刺激完成后,500 g離心5 min,棄上清。 10、加入5 mLPBS重懸細(xì)胞,500 g離心5 min,棄上清。 11.加入100 uLPBS重懸細(xì)胞加入APC-CD4抗體1 uL渦旅混勻.室溫避光反應(yīng)20 min. 12，每管加2 mL細(xì)胞固定液室溫避光孵育20 min.600 g離小5 min.棄上清。 13、每管加入2 mL細(xì)胞破膜液室溫避光孵育10 min.600 q離心5 min.棄上清。 14、每管加入2 mL細(xì)胞破膜液.600 g離心5 min,棄上清。 15、加入FITC-IL17A抗體1 uL渦旋混勻室溫避光孵育30 min。 16、每管加入2 mL細(xì)胞破膜液.600 g離心5 min,棄上清。17、每管加入300 uL PBS.渦旋混勻,上機(jī)檢測(cè)。 |
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