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醫(yī)學(xué)生物科研銅蟲(chóng) (小有名氣)
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免疫組織化學(xué)染色
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免疫組織化學(xué)染色法是指在抗體上結(jié)合熒光或可呈色的化學(xué)物質(zhì)，利用免疫學(xué)原理中抗原和抗體間專一性的結(jié)合反應(yīng)，檢測(cè)細(xì)胞或組織中是否有目標(biāo)抗原的存在，此方式不只可以用來(lái)測(cè)知抗原的表現(xiàn)量也可觀察抗原所表現(xiàn)的位置。只要是能夠讓抗體結(jié)合的物質(zhì)，也就是具有抗原性的物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、核酸、多糖、病原體等都可偵測(cè)。 常規(guī)的免疫組織化學(xué)染色法有ABC法、LSAB法(SP法)(Labelled streptavidim biotln)、真空負(fù)壓LSAB法、Envision TM Systems、免疫組化雙染色法(ⅰ) (Ionmuno-Histochemistry double staimimg method)、免疫組化的雙染色法(ⅱ) (Immuno-histochemistry double staining method)、細(xì)胞爬片免疫熒光染色法、真空負(fù)壓免疫熒光染色法染細(xì)胞爬片，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如下： 對(duì)免疫組織化學(xué)染色所得結(jié)果的判斷要持科學(xué)態(tài)度，根據(jù)對(duì)照實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確判斷陽(yáng)性和陰性結(jié)果，排除假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。為使實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確無(wú)誤，應(yīng)多次重復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。最后得出科學(xué)的結(jié)論。為達(dá)此目的，首先應(yīng)學(xué)會(huì)區(qū)別特異性和非特異性染色結(jié)果。非特異性染色的特點(diǎn)是：細(xì)胞和間質(zhì)染色無(wú)區(qū)別或間質(zhì)染色更強(qiáng)；染色無(wú)特定部位，無(wú)結(jié)構(gòu)性；染色五分布規(guī)律，某一部位均勻著色；染色出現(xiàn)在切片的干燥部位、邊緣、刀痕或組織折疊處。排除非特異性染色之后，應(yīng)確定特異性染色在組織細(xì)胞中的部位和程度，并且考慮是否有必要進(jìn)行半定量測(cè)定。 01 以抗原表達(dá)模式定位 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)彌散性分布，多數(shù)免疫組織化學(xué)染色為胞質(zhì)型陽(yáng)性反應(yīng)，如細(xì)胞角蛋白(Cytokeratin，CK)和波形蛋白(Vimentin)等。 細(xì)胞核周邊胞質(zhì)內(nèi)分布，其判別要點(diǎn)是細(xì)胞核輪廓被勾畫(huà)得很清楚，如CD3多克隆抗體的染色。 胞漿內(nèi)局限性點(diǎn)狀陽(yáng)性反應(yīng)，如CDI$抗體的染色。 細(xì)胞膜線性陽(yáng)性反應(yīng)，大多數(shù)淋巴細(xì)胞標(biāo)志物的染色均如此，如CD20。 細(xì)胞核陽(yáng)性反應(yīng)，如BrdU、Ki-67及雌、孕激素受體蛋白等。 有些抗原的陽(yáng)性表達(dá)可同時(shí)出現(xiàn)在細(xì)胞的不同部位，如細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜等。 02 陽(yáng)性染色結(jié)果定量 計(jì)算免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)方法是選擇每個(gè)樣品中10個(gè)非重疊視野，計(jì)算每個(gè)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞與總細(xì)胞數(shù)的百分比，取平均數(shù)，連續(xù)觀察和計(jì)算至少二個(gè)條件相同的樣品。得出數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后可在計(jì)算機(jī)Microsoft Excel中作出柱形圖。 另一種方法以染色陽(yáng)性強(qiáng)度和陽(yáng)性檢出率相結(jié)合而定，一般陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在0～25為陰性，25～50為+，50～75為++，75以上為+++。此種判定方法容易出現(xiàn)人為誤差，現(xiàn)已很少在論文中出現(xiàn)。 圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果。 針對(duì)以上的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，常規(guī)免疫組織化學(xué)染色在有些時(shí)候是不能滿足我們對(duì)實(shí)驗(yàn)的要求，這個(gè)時(shí)候就可能會(huì)用到一些非常規(guī)的免疫組織化學(xué)染色方法，比如全組織免疫組織化學(xué)染色，全組織免疫組織化學(xué)染色尤其是胚胎，是指組織并沒(méi)有切片，而是組織的一小塊進(jìn)行的整體染色方法。胚胎干細(xì)胞、胚胎發(fā)育學(xué)研究者以及神經(jīng)學(xué)者通過(guò)動(dòng)物的不同發(fā)育階段表達(dá)不同的目的蛋白這一特點(diǎn)而對(duì)不同階段的動(dòng)物全胚胎進(jìn)行染色。 全組織染色與免疫細(xì)胞化學(xué)以及冰凍切片染色十分類似。如果一種抗體可以應(yīng)用于冰凍切片（并不包括石蠟包埋的切片）染色中的話，那么在全胚胎染色中也是適用的。不同之處在于全胚胎染色的樣品比正常的切片樣品更大更厚。因此，固定、封閉、抗體孵育、洗脫、通透以及底物顯色過(guò)程都需要更長(zhǎng)的時(shí)間，以使得溶液可以滲透到達(dá)樣品的中心。雖然研究者們使用不一樣的次數(shù)，但必要的話這些步驟中的細(xì)節(jié)對(duì)于優(yōu)化實(shí)驗(yàn)也可以提供指導(dǎo)。 01 固定中很重要的一點(diǎn)： 使用同一種抗體時(shí)，在冰凍切片中成功使用的固定液，一般都適合用來(lái)做全組織染色的。然而，大多數(shù)研究人員偏好于使用4%多聚甲醛。雖然4%多聚甲醛的這個(gè)濃度是很低的，但這還是需要整個(gè)樣品等待長(zhǎng)時(shí)間以使得溶液可以滲透到樣品的中心。因此，這并不適合所有的抗體，這是由于4%多聚甲醛固定液引起的蛋白交聯(lián)會(huì)使很多抗體不能識(shí)別其抗原表位。 一般，石蠟切片需要進(jìn)行抗原修復(fù)。而由于抗原修復(fù)中的加熱步驟會(huì)損壞胚胎樣品，故胚胎樣品不需要加熱修復(fù)抗原這一步驟。如果多聚甲醛固定在組織整體固定中不可行的話，這就可能是因?yàn)榭贵w對(duì)于蛋白交聯(lián)比較敏感，那么就需要選擇其他的固定液。甲醇是人們?cè)诮M織整體免疫染色步驟中固定液的第二種常用選擇。 斑馬魚(yú)胚胎的固定和準(zhǔn)備需要額外的步驟以確保卵膜被徹底滲透。 02 獲取圖像： 觀看全胚胎圖像可以使其在爬片之前漂浮在一個(gè)盛有甘油溶液的培養(yǎng)皿中觀察。如果胚胎很小的話，可以使用甘油爬片后，蓋蓋玻片之前進(jìn)行觀察。 在這種情況下，可以在蓋玻片周圍滴加油脂，使其不易移動(dòng)且可以減少使用顯微鏡觀察時(shí)造成的蓋玻片的損壞。然而，如果通過(guò)全胚胎很難觀察一個(gè)清晰的染色圖像的話，也可以使用明膠對(duì)全胚胎進(jìn)行分開(kāi)后觀察，這種情況尤其適用于大的后期胚胎階段和大的組織樣品。 如果使用免疫熒光標(biāo)記的話，共聚焦顯微鏡是很好的觀察全胚胎的工具。這樣就不用在染色后又將全胚胎分成幾個(gè)玻片進(jìn)行觀察了。 03 選擇胚胎的年齡（階段）： 隨著胚胎的生長(zhǎng)，越大的胚胎越難染色。像固定液、抗體、顯影液等試劑也不易于滲透到樣品的中心，染色的細(xì)胞很難獲得一個(gè)清晰的圖像。那么，必要的話，大的或者后期的胚胎可以在染色之前可以將其分開(kāi)成幾塊。 推薦年齡：（1）雞胚胎：6天；（2）鼠胚胎：12天等 04 實(shí)驗(yàn)步驟： 獲取胚胎：列舉常見(jiàn)幾種。 雞：輕柔的將一個(gè)雞蛋打到一個(gè)干凈的中等大小的玻璃培養(yǎng)皿中。胚胎一般漂浮在蛋黃的頂端。使用干凈的剪刀和裝有槍頭的Pasteur移液管即可輕松的獲取胚胎。（這樣可以避免胚胎來(lái)自移液管窄尖頭的損壞） 鼠：在成年雌鼠中取胚胎。在預(yù)冷的PBS中解剖胚胎，盡可能移去不需要的組織。我們建議盡可能多的去除胚胎膜和額外不需要的組織。這能夠避免抗體散布到整個(gè)胚胎上。 果蠅：制備特殊瓊脂培養(yǎng)基，等果蠅產(chǎn)卵之后，用軟毛刷輕輕刷瓊脂表面，使酵母泥和胚胎脫落到水里。將水倒入篩子里。重復(fù)兩三次，使胚胎完全轉(zhuǎn)移到篩子里。將篩子半浸入盛水的容器里用毛刷洗一下，然后在自來(lái)水（開(kāi)小一點(diǎn)）下沖洗干凈，用稱量用的刮刀轉(zhuǎn)移到EP管里。 將胚胎用4%多聚甲醛固定液浸泡，置于4℃固定。固定的時(shí)間需要優(yōu)化。建議優(yōu)化的時(shí)間間于2h和過(guò)夜之間。 或者用m-DMSO（80%甲醇，20%的DMSO）固定。 一般地，使用同一種抗體時(shí)，在冰凍切片中成功使用的固定液，一般都適合用來(lái)做全組織染色的。然而，這也是需要做一些優(yōu)化的。 當(dāng)樣品完全浸透固定液時(shí)就會(huì)沉入溶液瓶底。注意在進(jìn)行接下來(lái)的步驟時(shí)一定要確保樣品沉入溶液底部。 用含0.5-1%trion的PBS清洗三次，每次30分鐘。 用封閉液（含1%Triton、10%胎牛血清、0.2%疊氮化鈉的PBS）室溫孵育胚胎1h。 阻斷過(guò)氧化物酶：將胚胎置于含0.1%H2O2的封閉液中4°C過(guò)夜。 用封閉液清洗胚胎2次。 將Pasteur移液管末端剪掉形成2ml的管子，用其轉(zhuǎn)移胚胎。加入合適濃度的一抗。 一般在全胚胎染色中抗體孵育的時(shí)間比較久，為了防止微生物的生長(zhǎng)，在稀釋一抗的封閉液中會(huì)加入0.02%的疊氮化鈉。 樣品在混合器上4°C緩慢旋轉(zhuǎn)孵育1-4天。根據(jù)不同的抗體以及胚胎的大小，孵育的時(shí)間需要進(jìn)行一些優(yōu)化。 用含1%Triton、10%胎牛血清和0.2%疊氮化鈉的PBS清洗胚胎3次，每次1h。 用含1%Triton的PBS清洗3次，每次10分鐘。為防止疊氮化鈉的殘留影響顯影時(shí)過(guò)氧化物酶的活性，清洗過(guò)程要徹底。 二抗孵育：用不含疊氮化鈉的封閉液稀釋二抗。 樣品在混合器上4°C緩慢旋轉(zhuǎn)孵育2-4天。 用含1%Triton的PBS清洗3次，每次10分鐘。 用DAB底物室溫孵育胚胎2-3h。 將胚胎轉(zhuǎn)移到一個(gè)碟子中，加入新鮮的配制的顯示底物（每1mlDAB加5ul的過(guò)氧化氫）。 用PBS清洗3次，使得樣品達(dá)到理想的染色強(qiáng)度。 爬片觀察胚胎：觀察分析前樣品于4°C避光儲(chǔ)存。 爬片注意事項(xiàng) 將樣品放置于100%的甘油中48h。當(dāng)樣品完全浸透甘油時(shí)會(huì)沉入瓶子底部。在進(jìn)行下一步操作前一定要確保樣品完全浸透甘油。 明膠常用來(lái)爬片，將樣品裝置于玻片上。而75%的甘油的密度和明膠的密度接近，故樣品在染色后要浸透在75%的甘油中約15分鐘。當(dāng)樣品完全浸透甘油時(shí)會(huì)沉入瓶子底部。 將樣品置于50%的甘油中直到完全沉入瓶底。胚胎這個(gè)時(shí)候就可以觀察了，或者爬片后觀察。在蓋玻片周圍滴加油脂保護(hù)。 如果樣品包埋在明膠中切片的話，可將20%的明膠65°C預(yù)熱，在樣品爬片前，將其置于明膠中約30分鐘，使其完全浸透。當(dāng)樣品完全浸透時(shí)，會(huì)沉入瓶子底部。 |
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請(qǐng)問(wèn)有做大鼠M1型小膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD86的免疫熒光冰凍切片染色成功的嗎？
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