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醫(yī)學(xué)生物科研銅蟲 (小有名氣)
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[交流]
透射電鏡實驗技術(shù)
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透射電子顯微鏡結(jié)構(gòu)和成像原理 透射電子顯微鏡結(jié)構(gòu)包括兩大部分:主體部分為照明系統(tǒng)、成像系統(tǒng)和觀察照相室;輔助部分為真空系統(tǒng)和電氣系統(tǒng)。 透射電鏡的應(yīng)用 透射電子顯微鏡在材料科學(xué)、生物學(xué)上應(yīng)用較多。由于電子易散射或被物體吸收,故穿透力低,樣品的密度、厚度等都會影響到最后的成像質(zhì)量,必須制備更薄的超薄切片,通常為50～100nm。所以用透射電子顯微鏡觀察時的樣品需要處理得很薄。 常用的方法 超薄切片法、冷凍超薄切片法、冷凍蝕刻法、冷凍斷裂法等。對于液體樣品,通常是掛預(yù)處理過的銅網(wǎng)上進行觀察。 樣本制備方法 由于電鏡電子束穿透能力的限制,必須把標(biāo)本切成厚度小于0.1um以下的薄片才適用,這種薄片稱為超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。 在透射電鏡的樣品制備方法中,超薄切片技術(shù)是最基本、最常用的制備技術(shù)。超薄切片的制作過程基本上和石蠟切片相似,需要經(jīng)過取材、固定、脫水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步驟。 一. 取材 基本要求組織從生物活體取下以后,如果不立即進行適當(dāng)處理,會由于細胞內(nèi)部各種酶的作用,出現(xiàn)細胞自溶現(xiàn)象。此外,還可能由于污染,微生物在組織內(nèi)繁殖使細胞的微細結(jié)構(gòu)遭受破壞。因此,為了使細胞結(jié)構(gòu)盡可能保持生前狀態(tài),必須做到快、小、準(zhǔn)、冷: (1).動作迅速,組織從活體取下后應(yīng)在最短時間內(nèi) (爭取在1分鐘內(nèi)) 投入2.5%戊二醛固定液。 (2).所取組織的體積要小,一般不超過1mm×1mm×1mm。也可將組織修成1mm×1mm×2mm大小長條形。因為固定劑的滲透能力較弱,組織塊如果太大,塊的內(nèi)部將不能得到良好的固定。 (3).機械損傷要小,解剖器械應(yīng)鋒利,操作宜輕,避免牽拉、挫傷與擠壓。 (4).操作最好在低溫(0℃～4℃)下進行,以降低酶的活性,防止細胞自溶。 (5).取材部位要準(zhǔn)確。取材方法:將取出的組織放在潔凈的蠟版上,滴一滴預(yù)冷的固定液,用兩片新的、鋒利的刀片成“拉鋸式”將組織切下并修小,然后用牙簽或鑷子將組織塊移至盛有冷的固定液的小瓶中。如果組織帶有較多的血液和組織液,應(yīng)先用固定液洗幾遍,然后再切成小塊固定。 二.固定 固定的目的是盡可能使細胞中的各種細胞器以及大分子結(jié)構(gòu)保持生活狀態(tài),并且牢固地固定在它們原來所在的位置上。固定的方法有物理的和化學(xué)的兩大類。物理的方法系采用冰凍、干燥等手段來保持細胞結(jié)構(gòu);化學(xué)的方法是用一定的化學(xué)試劑來固定細胞結(jié)構(gòu)�，F(xiàn)通常使用化學(xué)方法對組織或細胞進行固定。 常用固定劑 1、四氧化鋨 (osmium tetroxide,)是一種強氧化劑,與氮原子有較強的親和力,因而對于細胞結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)成分有良好的固定作用。它還能與不飽和脂肪酸反應(yīng)使脂肪得以固定。此外,四氧化鋨還能固定脂蛋白,使生物膜結(jié)構(gòu)的主要成分磷脂蛋白穩(wěn)定。它還能與變性DNA以及核蛋白反應(yīng),但不能固定天然DNA、RNA及糖原。四氧化鋨固定劑有強烈的電子染色作用,用它固定的樣品圖象反差較好。鋨固定的時間一般為1-2小時。 2.戊二醛 (glutaraldehyde C5H8O2),戊二醛的優(yōu)點是對糖原、糖蛋白、微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞基質(zhì)等有較好的固定作用,對組織和細胞的穿透力比四氧化鋨強,還能保存某些酶的活力,長時間的固定(幾周甚至1～2個月)不會使組織變脆。 缺點是不能保存脂肪,沒有電子染色作用,對細胞膜的顯示較差。 組織塊固定常規(guī)采用戊二醛—鋨酸雙重固定法。分預(yù)固定和后固定,中間用磷酸緩沖液漂洗。前固定用2.5%戊二醛固定2小時以上、后固定用1%鋨酸固定液固定1～2小時,pH7.3～7.4。 固定完畢,用緩沖液漂洗20分鐘后進行脫水。 細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)冷凍割斷法 1.取材和固定:為了使細胞結(jié)構(gòu)清晰,不被過多的血細胞污染,可在取材前用灌注法沖洗。即先將動物麻醉,經(jīng)腹主動脈注入生理鹽水或低分子量的右,切開下腔靜脈放血,至無血色為止。然后迅速取材,將樣品修成1mm×1mm×5mm大小,投入1%鋨酸溶液中固定1小時,用1/15M磷酸緩沖液 (pH7.4)清洗兩次,每次10分鐘。 2.二甲基亞 浸泡:將樣品依次放入25%、50%二甲基亞砜溶液中,各浸泡30分鐘。 3.割斷:用TF—1型冷凍割斷裝置進行割斷。然后將割斷后的樣品放到50%二甲基亞砜中,等融化后再用1/15M磷酸緩沖液浸洗,每次10分鐘,換液5次。 4.軟化及后固定:將樣品放入0.1%鋨酸中軟化,溫度20(C,時間48～72小時。然后用1% 八 固定1小時,雙蒸水浸洗1小時,換液幾次,需徹底清洗干凈。 5.導(dǎo)電染色:將樣品放入2%丹寧酸中2小時(或過夜),以雙蒸水清洗1小時,換液幾次。再以1% 八 固定30～60分鐘,雙蒸水清洗1小時。 6.脫水、干燥及鍍膜:按常規(guī)方法進行。 掃描電鏡技術(shù)服務(wù) 掃描電鏡成象原理 掃描電鏡主要用二次電子觀察形貌,在掃描電鏡中,電子槍發(fā)射出來的電子束,經(jīng)三個電磁透鏡聚焦后,成直徑為幾個納米的電子束。末級透鏡上部的掃描線圈能使電子束在試樣表面上做光柵狀掃描。試樣在電子束作用下,激發(fā)出各種信號,信號的強度取決于試樣表面的形貌、受激區(qū)域的成分和晶體取向。設(shè)在試樣附近的探測器把激發(fā)出的電子信號接受下來,經(jīng)信號處理放大系統(tǒng)后,輸送到顯象管柵極以調(diào)制顯象管的亮度。由于顯象管中的電子束和鏡筒中的電子束是同步掃描的,顯象管上各點的亮度是由試樣上各點激發(fā)出的電子信號強度來調(diào)制的,即由試樣表面上任一點所收集來的信號強度與顯象管屏上相應(yīng)點亮度之間是一一對應(yīng)的。因此,試樣各點狀態(tài)不同,顯象管各點相應(yīng)的亮度也必不同,由此得到的象一定是試樣狀態(tài)的反映。放置在試樣斜上方的波譜儀和能譜儀是用來收集X射線,借以實現(xiàn)X射線微區(qū)成分分析的。值得強調(diào)的是,入射電子束在試樣表面上是逐點掃描的,象是逐點記錄的,因此試樣各點所激發(fā)出來的各種信號都可選錄出來,并可同時在相鄰的幾個顯象管上顯示出來,這給試樣綜合分析帶來極大的方便。 掃描電鏡取材要求 由于電鏡電子束穿透能力的限制,必須把標(biāo)本切成厚度小于0.1um以下的薄片才適用,這種薄片稱為超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。 在透射電鏡的樣品制備方法中,超薄切片技術(shù)是最基本、最常用的制備技術(shù)。超薄切片的制作過程基本上和石蠟切片相似,需要經(jīng)過取材、固定、脫水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步驟。 提示 透射電鏡標(biāo)本先應(yīng)用超薄切片機(Ultrotome)進行切片,再經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定,丙酮脫水,環(huán)氧樹脂包埋,超薄切片,醋酸枸椽酸電子又重染色,透射電鏡觀察。 掃描電鏡標(biāo)本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定,乙醇逐級脫水,CO2臨界點干燥,真空噴金,掃描電鏡觀察。 |
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