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醫(yī)學(xué)生物科研銅蟲(chóng) (小有名氣)
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[交流]
實(shí)驗(yàn)總結(jié) IP 和Co-IP服務(wù)
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免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)是利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法。抗體與細(xì)胞裂解液或表達(dá)上清中相應(yīng)的蛋白結(jié)合后,再與蛋白A/G(ProteinA/G)或二抗偶聯(lián)的agarose或Sepharose珠子孵育,通過(guò)離心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗體-目的蛋白復(fù)合物,沉淀經(jīng)過(guò)洗滌后,重懸于電泳上樣緩沖液,煮沸5-10min,在高溫及還原劑的作用下,抗原與抗體解離,離心收集上清,上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。 免疫共沉淀(Co- Immunoprecipitation, Co-IP)是利用抗原和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌的Protein A或G特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的Fc片段的現(xiàn)象開(kāi)發(fā)出來(lái)的方法。其基本原理是,在細(xì)胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體,孵育后再加入與抗體特異結(jié)合的結(jié)合于Agarose珠上的Protein A或G,若細(xì)胞中有與興趣蛋白結(jié)合的目的蛋白,就可以形成這樣一種復(fù)合物:“興趣蛋白—抗性蛋白抗體—Protein A或G—Agarose珠”,經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,復(fù)合物又被分開(kāi)。然后經(jīng)免疫印跡或質(zhì)譜檢測(cè)目的蛋白。這種方法得到的目的蛋白是在細(xì)胞內(nèi)與興趣蛋白天然結(jié)合的,符合體內(nèi)實(shí)際情況,得到的結(jié)果可信度高。這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合;也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。 優(yōu)點(diǎn) (1)相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的,處于天然狀態(tài); (2)蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的,可以避免人為的影響; (3)可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。 缺點(diǎn) (1)可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用; (2)兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合,而可能有第三者在中間起橋梁作用; (3)必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么,以選擇最后檢測(cè)的抗體,所以,若預(yù)測(cè)不正確,實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果,方法本身具有冒險(xiǎn)性。 (4)靈敏度沒(méi)有親和色譜高。 服務(wù)要求 提供新鮮樣本材料和IP及WB的一抗(或由我公司代購(gòu)) 注:免疫共沉淀(co-IP)通常必須使用未經(jīng)凍存的新鮮蛋白樣品。普通的免疫沉淀雖然可以使用凍存的蛋白樣品,但也宜用新鮮的蛋白樣品為佳。 |
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