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angkuLC新蟲 (初入文壇)
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[求助]
求助用于絕對定量的菌懸液提取DNA的方法
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背景： 1. 菌懸液只包含大腸桿菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌（革蘭氏陽性菌）。 2. 根據(jù)（不太準(zhǔn)的）涂板的結(jié)果，菌懸液中細(xì)菌個體含量在10^4-10^12之間變化，并且因?yàn)閷?shí)驗(yàn)處理中會加季銨鹽殺死細(xì)菌，有時不太能直接用OD值估測個體含量。 3. 提取DNA后使用qPCR做絕對定量。 之前的經(jīng)歷： 一開始使用的試劑盒（天根）+溶菌酶，但是注意到說明書上寫提取的細(xì)胞數(shù)量級在10^6-10^8之間，問了下客服說再多了可能會堵塞柱子。并且由于溶菌酶這一步的加入，整個提取DNA的時長增加了不少，所以想替換成其他的方法。溶菌酶想用玻璃珠（glass beads）替換以節(jié)省時長，試劑盒法想用煮沸法替換以突破數(shù)量級限制。同時如果煮沸法殘留很多雜質(zhì)的話，在冷卻后再加入RNA酶和蛋白酶K。 問題： 1. 殘留的RNA和蛋白質(zhì)會影響DNA的qPCR的曲線嗎？ 2. 如果按照試劑盒說明加入RNA酶和蛋白酶K分解RNA和蛋白質(zhì)，在做qPCR之前是否還需要去除剩余的物質(zhì)（分解后的物質(zhì)、這兩個酶）？不清楚protocol上是否有步驟是做這步的？（說明書鏈接:https://pan.baidu.com/s/1VziNdgbXgAunwEg3XlMqdQ 提取碼:6awy）（這個廠家技術(shù)能給說嗎） 3. 為什么用玻璃珠法的比用溶菌酶法的protocol這么少，是有什么缺陷嗎？ |
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