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醫(yī)學(xué)生物科研銅蟲(chóng) (小有名氣)
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【實(shí)驗(yàn)總結(jié)】小談流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡
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正常細(xì)胞中的磷脂酰絲氨酸(PhosphatidylserinePS)位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)PS會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面即暴露在細(xì)胞的外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量在35~36KD的Ca2+依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白與PS有極高高親和力可以與之發(fā)生特異性結(jié)合將Annexin-V進(jìn)行熒光素(FITC)標(biāo)記成Annexin-V. FITC探針用該探針標(biāo)記待檢測(cè)細(xì)胞利用流式儀通過(guò)檢測(cè)FITC信號(hào)即可反應(yīng)帶警車(chē)細(xì)胞的凋亡情況。 當(dāng)然對(duì)于現(xiàn)有的凋亡檢測(cè)試劑并沒(méi)有滿足于整體調(diào)亡情況的反映一般的試劑會(huì)結(jié)合碘化丙啶(propidineiodide.PI)進(jìn)行更細(xì)層面的檢測(cè)。PI是一種核酸染料它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜但在調(diào)亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞細(xì)胞膜一般會(huì)發(fā)生破裂此時(shí)PI能夠細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)嵌入到DNA中使細(xì)胞核釋放紅色熒光。 在操作過(guò)程中不論是分離組織細(xì)胞或是收集培養(yǎng)中的細(xì)胞需盡量避免污染一般收集1*106的細(xì)胞制備成1mL的細(xì)胞懸液按照凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作即可但一定要注意整個(gè)過(guò)程需要輕柔操作以免造成細(xì)胞是寫(xiě)損傷而影響檢測(cè)結(jié)果。探針?lè)跤瓿珊笮柙?小時(shí)以?xún)?nèi)完成檢測(cè)另外上機(jī)檢測(cè)時(shí)記得配上不做任何標(biāo)記的陰性對(duì)照管哦。 對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果首先我們需要在細(xì)胞自身光散射特性方面進(jìn)行評(píng)判。調(diào)亡細(xì)胞形態(tài)上的改變影響它們的光散射特性。在流式細(xì)胞儀上前向散射光與細(xì)胞的大小有關(guān)而側(cè)向散射光反映的是光在細(xì)胞內(nèi)的折射作用與細(xì)胞內(nèi)的顆粒多少有關(guān)。在細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞固縮體積變小故前向散射光降低這一特性往往被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的特點(diǎn)之一。此外細(xì)胞調(diào)亡時(shí)由于染色體降解核破裂形成細(xì)胞內(nèi)顆粒往往增多故凋亡細(xì)胞側(cè)向散射光常增加。細(xì)胞壞死時(shí)由于細(xì)胞腫脹其前向散射光增大側(cè)向散射光在細(xì)胞壞死時(shí)也增大因此可根據(jù)前向散射光和側(cè)向散射光區(qū)別調(diào)廣細(xì)胞和壞死細(xì)胞。但需要注意的是根據(jù)前散射光和側(cè)向散射光判斷凋廣細(xì)胞的可靠性受被檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)上的均一性和核胞漿比率影響很大。因此我們必須要進(jìn)行調(diào)亡因子的直接反映。 前面我們提到凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞由于其細(xì)胞膜損傷Pl能夠穿透細(xì)胞膜而嵌入DNA中是細(xì)胞核產(chǎn)生紅色熒光。而細(xì)胞膜保持完好的早期凋亡細(xì)胞對(duì)于細(xì)胞活性鑒定的染料PI有抗染性則不會(huì)有紅色熒光產(chǎn)生正�；罴�(xì)胞與之相似。在雙變顯流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上所呈現(xiàn)的結(jié)果即為左上象限顯示機(jī)械損傷細(xì)胞為(FITC-/PI+)左下象限顯示活細(xì)胞為(FITC-/PI-)右上象限是非活細(xì)胞即壞死細(xì)胞或晚期凋亡細(xì)胞為(FITC+/PI+)而右下象限為早期調(diào)亡細(xì)胞呈現(xiàn)(FITC+/PI-)。 最后提醒一下想要做流式凋亡檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)的科研汪們由于用流式檢測(cè)凋亡時(shí)PI受時(shí)間的影響很大,因?yàn)闃?biāo)記了PI后會(huì)加大細(xì)胞毒性隨著時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致PI的染色增加特別是檢測(cè)早期凋亡時(shí),如果時(shí)間延長(zhǎng)除了會(huì)導(dǎo)致在流式細(xì)胞儀上的細(xì)胞分群差距加大外誤差會(huì)明顯加大。根據(jù)以前做流式凋亡時(shí)的經(jīng)驗(yàn)建議每組實(shí)驗(yàn)一次可以先做三個(gè)復(fù)孔上機(jī)前5分鐘加Pl最好在半小時(shí)內(nèi)檢測(cè)完畢。這時(shí)可以先分析下三個(gè)復(fù)孔的差異。等待摸索的實(shí)驗(yàn)條件成熟后每組實(shí)驗(yàn)一次可以做6~8個(gè)復(fù)孔然后做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。嚴(yán)格說(shuō)來(lái)當(dāng)做出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異時(shí)這樣的實(shí)驗(yàn)還要重復(fù)三次。但是因檢測(cè)凋亡時(shí)，受細(xì)胞狀態(tài)PI染色時(shí)間，流式檢測(cè)時(shí)間,以及每次實(shí)驗(yàn)時(shí)的誤差等的影響外很難保證能夠完全重復(fù)出上次的結(jié)果甚至即使在保證了實(shí)驗(yàn)條件幾乎相同的情況下每次重復(fù)的差異也會(huì)中現(xiàn)加大的情況。這時(shí)可以話當(dāng)重復(fù)2~3次盡量使差異減小。 |
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