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Tiancccccc鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
selex篩選核酸適配體，pcr擴增后產(chǎn)率極低
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 各位大佬求指導(dǎo) ! ! !期待大家廣泛討論 問題：我采用磁珠法篩選適配體，但是得到的目的產(chǎn)物量極少，無法開展后續(xù)實驗。二次擴增會放大擴增偏好，所以還是想只擴增一次，提高PCR產(chǎn)率。 大致篩選情況如下：我采用羧基磁珠偶聯(lián)目標蛋白，然后與76 nt的DNA文庫（5’-TTCAGCACTCCAGGCATAGC-N(36)-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’ ）孵育，洗脫未結(jié)合的文庫，加入200 uL pH 7.4的hepes溶液（20 mM HEPES, 0.05 M NaCl, 2 mM CaCl2, pH 7.4）煮沸磁珠，使文庫變性脫落到溶液中，將溶液用于PCR擴增，pcr擴增程序設(shè)置為：step 1，95 ℃, 3 minstep 2，95 ℃, 30 s；60 ℃, 30 s；72 ℃, 30 sstep 3，Go to step 2 for 34 cyclesstep 4，72 ℃， 5 minstep 5，4 ℃，forever（pcr之前做過QPCR，計算出擴增效率正常）另外，大概是因為擴增次數(shù)過多，產(chǎn)生的非特異性條帶也很多。 完后，正丁醇濃縮PCR產(chǎn)物體積至100 uL左右，采用10% denaturing PAGE gel分離目的條帶，切膠，elution buffer提取，正丁醇濃縮，乙醇沉淀，真空旋干，最終得到約2 ug的產(chǎn)物（文庫），難以進行后續(xù)實驗。 個人設(shè)想會不會是篩選緩沖液影響（試過投入相同量的DNA模板，buffer用水，但也沒有提高多少產(chǎn)率），模板投入量提高后產(chǎn)率略有提高，或者煮沸液中含有pcr抑制劑（QPCR的Ct值在11輪左右，感覺可以排除這個原因）后續(xù)打算用原始文庫擴增試一下，看產(chǎn)率是否提高，再次排除抑制劑的影響�；蛘呙恳惠喌膒cr都需要進行條件優(yōu)化嗎，關(guān)于退火時間，溫度，循環(huán)數(shù)。擴增循環(huán)數(shù)增加，非特異性條帶增多會導(dǎo)致目的產(chǎn)物變少嗎？剛接觸到適配體篩選以及PCR這些技術(shù)，還挺懵的，請大家指導(dǎo)一下。 真心期待大家一起討論，感謝大佬相助 |
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