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醫(yī)學(xué)生物科研銅蟲 (小有名氣)
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【動物造模】小鼠腦脊髓炎EAE
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國內(nèi)外學(xué)者試用多種易感動物建立EAE模型,以期闡明MS及EAE的發(fā)病機(jī)制,并為其病情的監(jiān)測、復(fù)發(fā)的預(yù)防、治療方案的選擇以及新療法或新藥物的篩選等提供可靠依據(jù)。本文就近年來EAE模型方面的研究綜述如下。 1.1 品系 從鳥類到哺乳類的多種動物如雞、小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、羊、犬、猴等均可成功誘發(fā)EAE,但不同種屬或同一種屬不同品系動物的敏感性有很大差異。對EAE敏感的動物有Lewis、DA大鼠,PL/J、SJL/J小鼠,Hartley、Strain13豚鼠。雖然豚鼠對誘發(fā)EAE相當(dāng)敏感,但其品系復(fù)雜,有關(guān)試劑缺乏,一般不常用作實(shí)驗(yàn)對象。相比之下大鼠及小鼠的背景知識及相關(guān)試劑則較為全面,遺傳學(xué)、免疫學(xué)等方面的研究也較深入,且其EAE在臨床、病理、免疫及生化改變等方面都與人類脫髓鞘疾病較為相似,因此應(yīng)用最為廣泛。 用大鼠制備EAE有許多優(yōu)點(diǎn),如品系多,選擇余地大,繁殖快,同一品系中個體間差異小,實(shí)驗(yàn)方便。其中Lewis大鼠誘發(fā)的EAE具有穩(wěn)定性好、敏感性高等特點(diǎn),其病程為單相,多數(shù)可自行恢復(fù),對再次誘發(fā)很快產(chǎn)生強(qiáng)的耐受性,多用作EAE激發(fā)和緩解機(jī)制的研究。而SJL/L及PL/J小鼠對再次誘發(fā)的敏感性沒有明顯降低,且?guī)缀蹩梢姷饺祟怣S的所有病理改變,可誘發(fā)出更接近于人類MS的緩解復(fù)發(fā)型EAE模型,但它的EAE發(fā)生率及潛伏期變化較大。人們對小鼠的遺傳背景了解得比較清楚,因此小鼠更適用于有關(guān)基因、細(xì)胞間作用等領(lǐng)域的研究。然而不同品系小鼠對EAE的敏感性也不同,有人將其分為EAE—易感(EAE—susceptible)和EAE—抵抗(EAE?resistant)兩種類型�；蛐头治鼋Y(jié)果表明,單倍型為H?2s的小鼠(如SJL/J)及H?2q的小鼠(如DBA1/J)屬于EAE—易感型。C57BL/10J及P/J小鼠可發(fā)生輕微的脫髓鞘病變。BABL/C和AKR/J小鼠基本不發(fā)生EAE,被認(rèn)為是EAE—抵抗小鼠。 不同品種或同一品種不同品系動物對EAE的易感性主要受免疫反應(yīng)基因(Ir基因)影響,Ir基因的調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)為T細(xì)胞表面受體對髓鞘堿性蛋白(MBP)的特異性表達(dá)。動物的種類不同,其受體表達(dá)能力不同,對自身抗原的反應(yīng)性不同,因而對EAE的易感性也不同,因此在選擇動物時需要尋找EAE模型的敏感動物。 鑒于對EAE敏感的Lewis、DA大鼠,PL/J,SJL/J小鼠的價(jià)格昂貴、不宜獲得且難以飼養(yǎng),國內(nèi)多采用價(jià)廉易得的Wistar大鼠,但其敏感性不及前者。 1998年Jon等用猴建立了EAE動物模型,與嚙齒類EAE模型相比,其特征更接近人類脫髓鞘疾病MS,并能以磁共振評估白質(zhì)損害和神經(jīng)組織病理改變。 EAE發(fā)病有多種誘發(fā)因素,包括食物、藥物及感染等。大鼠的飼養(yǎng)環(huán)境級別越高,清潔度越高,接觸誘發(fā)因素的幾率越小,在相同條件下致敏,其發(fā)病率就越低,因此選用普通動物即可。最近有報(bào)道說明,EAE的發(fā)病還與動物的血腦屏障的形成有關(guān)。 1.2 年齡 EAE的發(fā)生發(fā)展與年齡密切相關(guān)。幼齡動物發(fā)病后癥狀很快達(dá)到高峰,隨后又迅速恢復(fù),和成年動物相比病程較短,其抗原注射部位及CNS內(nèi)的炎性細(xì)胞浸潤程度較輕,并且幼齡動物體重偏小,一般情況差,易出現(xiàn)麻醉意外而死亡。若動物體重(周齡)偏大,則發(fā)病延遲,且癥狀較重,所以選擇受試動物以青年期為佳。但若作為抗原提供者,其年齡可適當(dāng)放寬,一般大于4周即可。 1.3 性別 MS多為青年女性,EAE的發(fā)生發(fā)展也存在性別差異。一般來講,雌性動物較雄性敏感,表現(xiàn)在雌性動物的發(fā)病率高,臨床癥狀相對嚴(yán)重,如Wistar大鼠及SJL/J小鼠,但也有的動物如Lewis大鼠,雄性較雌性敏感。另外實(shí)驗(yàn)時間選擇在夏季比冬春季節(jié)誘導(dǎo)動物模型的敏感性更高。敏感性高的動物,有時癥狀較嚴(yán)重且死亡率高,應(yīng)引起注意。 抗原的選擇 常用的致敏抗原有髓鞘堿性蛋白(MBP)或其多肽片斷(如MBP peptide 89—101)以及蛋白脂(PLP)等。長期以來MBP和PLP被認(rèn)為是引起EAE和MS的主要抗原,MBP是髓鞘中抗原性最強(qiáng)的蛋白質(zhì),占髓鞘總蛋白的40%,等電點(diǎn)在10以上,是強(qiáng)堿性蛋白質(zhì)。研究表明MBP可激活體內(nèi)Th+細(xì)胞,使之穿過血腦屏障,攻擊自身神經(jīng)髓鞘的MBP,從而導(dǎo)致中樞神經(jīng)白質(zhì)脫髓鞘,引起EAE或MS。近年來多用MBP肽代替MBP免疫動物。PLP是高度疏水的膜蛋白,對PLP不同肽決定簇發(fā)生反應(yīng)的CD4+T細(xì)胞能誘導(dǎo)急性、慢性復(fù)發(fā)型及慢性進(jìn)展型EAE。在MS患者體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)與PLP抗原決定簇發(fā)生反應(yīng)的T細(xì)胞。 最近研究表明,體內(nèi)含量較少的髓蛋白,如髓寡樹突細(xì)胞糖蛋白(MOG)、髓堿相關(guān)糖蛋白(MAG)等也是很強(qiáng)的抗原。髓鞘素(Myelin)、脊髓組織勻漿(SCH)、腦組織勻漿(BH)等也可作為致敏抗原。某些非髓性蛋白,如神經(jīng)原蛋白(neuronal protein,S100β)、膠原纖維酸蛋白(GFAP)也參與EAE的發(fā)病。 通常不同品種動物對同一抗原的敏感性不同、不同抗原的抗原性也不同,并且不同來源的同一抗原的活性也有明顯差異。一般情況下,抗原性強(qiáng)弱依次為豚鼠脊髓>大鼠脊髓>牛脊髓,脊髓組織>腦組織,豚鼠MBP>牛MBP。蛋白或多肽單體不但結(jié)構(gòu)明確,而且可以精確定量,因此利于進(jìn)行EAE發(fā)病機(jī)制研究,但不易獲得。脊髓勻漿和腦組織勻漿兩種抗原均含有多種抗原表位,且易于獲得,適用于多種動物,但其成分復(fù)雜,不易精確定量,這給某些特殊研究造成不便。誘導(dǎo)鼠類產(chǎn)生EAE的異種抗原,以新鮮豚鼠脊髓制備的抗原佐劑乳化物為最好。在一定范圍內(nèi)抗原的量和EAE的發(fā)病率及發(fā)病程度有相關(guān)性,注射抗原佐劑乳化物的劑量越大,EAE的發(fā)病率越高�？乖膭┝靠梢騽游锏钠废�、抗原種類、免疫方法、研究目的等的不同而有很大變化。另外,抗原的物理狀態(tài)也很重要,高分散度的抗原易于被吞噬和遞呈,進(jìn)而較高效率地激活免疫系統(tǒng)。 佐劑的選擇 提取的抗原需與佐劑混合制成抗原乳劑后才能致敏動物�？乖魟榉翘禺愋悦庖咴鰪�(qiáng)劑,它可改變抗原的物理性狀,延長抗原在體內(nèi)的儲留時間,刺激抗原提呈細(xì)胞及淋巴細(xì)胞,從而增強(qiáng)和擴(kuò)大免疫應(yīng)答效果,它還能引起遲發(fā)性血腦屏障通透性增加和自身免疫反應(yīng)。最常用的佐劑為完全弗氏佐劑(CFA),CFA在提高抗體的幅度和持久性方面是當(dāng)今作用最強(qiáng)的佐劑。國外一般均采用人型結(jié)核桿菌(H37Ra)作為弗氏佐劑。不同實(shí)驗(yàn)室所用的致敏抗原及佐劑中分枝結(jié)核桿菌蛋白濃度有所差別,提高結(jié)核桿菌的濃度,可提高EAE 的發(fā)生率及復(fù)發(fā)率,但也容易引起注射部位壞死。由于H37Ra在國內(nèi)不易獲得,常采用廉價(jià)易得的卡介苗(BCG)來代替。 百日咳桿菌疫苗(BPV)毒素能增加血管壁的通透性和血管表面粘附分子的表達(dá),有利于致敏的T細(xì)胞透過血腦屏障,攻擊神經(jīng)髓鞘,造成對腦、脊髓組織的免疫損傷。于CFA中加入BPV可明顯縮短Wistar大鼠EAE的潛伏期,提高其發(fā)病率,加重其臨床癥狀,對EAE有明顯的促發(fā)作用。在用GPSCH誘導(dǎo)Wistar大鼠EAE的同時,給予BPV 可使EAE的潛伏期、發(fā)病率、臨床癥狀、體重及病理改變等方面與敏感的Lewis大鼠EAE的上述表現(xiàn)近似。 模型制備方法 EAE是實(shí)驗(yàn)動物通過神經(jīng)組織(其中的某些成分)或病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的。EAE的誘導(dǎo)有主動誘導(dǎo)法和被動誘導(dǎo)法兩種。不同的免疫方法,可影響抗原遞呈,激發(fā)不同的免疫反應(yīng),這不但影響EAE的發(fā)生率,還可影響其發(fā)展與轉(zhuǎn)歸。 通常采用主動誘導(dǎo)法制備EAE模型,將抗原與佐劑的混合乳劑直接注射至動物體內(nèi),經(jīng)過一定時間的潛伏期,誘導(dǎo)EAE的產(chǎn)生。抗原注射部位的不同,可影響EAE的發(fā)生率、潛伏期、死亡率及復(fù)發(fā)率。常用的注射部位有腳墊、頸部及背部(皮下、皮內(nèi)、肌肉)、腹腔和尾靜脈等多種,其中以皮下多點(diǎn)注射及腳墊注射的發(fā)病率最高,而頸部注射則有較高的復(fù)發(fā)率。 因多次注射易引發(fā)免疫耐受,現(xiàn)在多采用單次注射抗原法。 EAE的被動轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)是研究其發(fā)病機(jī)制的最直接證據(jù),也是研究EAE的治療及預(yù)防措施的良好模型。將抗原激活的PLP特異性T細(xì)胞轉(zhuǎn)輸給同一品系的正常大鼠或小鼠,也可引起EAE。MBP特異性自身反應(yīng)性T細(xì)胞在MS的發(fā)病機(jī)制中也起著關(guān)鍵作用,T細(xì)胞必須先在外周活化,通過血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入CNS才能致病 |
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