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醫(yī)學(xué)生物科研銅蟲(chóng) (小有名氣)
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科研干貨｜13種蛋白提取方法
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No.1 一單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取 1.倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫?huì)兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。 每瓶細(xì)胞加3ml 4℃預(yù)冷的PBS（0.01M pH=7.2～7.3）。平放輕輕搖動(dòng)1min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將P2.BS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。 3.按1ml裂解液加10μl PMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無(wú)結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。） 4.每瓶細(xì)胞加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來(lái)回?fù)u動(dòng)。 5.裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動(dòng)作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行。） 6.于4℃下12000 rpm離心5min。（提前開(kāi)離心機(jī)預(yù)冷） 7.將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5min的離心管中放于-20℃保存。 No.2組織中總蛋白的提取 1.將少量組織塊置于1～2ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。 2.加400μl單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。 3.幾分鐘后再碾一會(huì)兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。 4.裂解30min后，即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然后在4℃下12000 rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20℃保存。 No.3 加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提取 1.由于受藥物的影響，一些細(xì)胞脫落下來(lái)，所以除按1）操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。 2.培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提取 3.將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中，于2500 rpm離心5min。 4.棄上清，加入4ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500 rpm離心5min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。 5.用槍洗干上清后，加100μl裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解過(guò)程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。 6.將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20℃保存。 No.4 1.Loading Buffer煮細(xì)胞抽提總蛋白 2.細(xì)胞計(jì)數(shù)（約1×106的細(xì)胞），離心收集細(xì)胞（2000rpm×5min）； 3.預(yù)冷1×PBS 500ul重懸洗一次，轉(zhuǎn)至500ul EP管（2000rpm×5min）； 4.去上清，后甩一次，將上清去盡； 5.按每1×106的細(xì)胞加50ul loading buffer 加入2×loading； 6.Vortex一下，煮10～15min一次×2～3次直至無(wú)粘絲； 7.每次煮好將其放于冰上，靜置約2min，Vortex一下，再甩一下； 8.三次后用槍吸起，如沒(méi)有粘絲，即可； 9.每次上樣約5ul（50ug/ul蛋白） No.5 .RIPA裂解抽提總蛋白 1..細(xì)胞計(jì)數(shù)（約1×107的細(xì)胞），離心收集細(xì)胞（2000rpm×5min）； 2..預(yù)冷1×PBS 1ml重懸洗2次，轉(zhuǎn)至1.5ml EP管（2000rpm×5min）； 3..去上清，后甩一次，將上清去盡； 4..按照如下比例加入裂解試劑： 5..RIPA：300ul/1×107細(xì)胞 6..PMSF：3ul(1:100) 7..Cocktail：0.3ul(1:1000) 8..吹打均勻，冰上放置30-40min，中間每10分鐘Vortex一次； 9..4℃預(yù)冷離心：10000rpm ×10min； 10.收集上清，轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷新EP管，即為總蛋白。 . No.6 核、漿蛋白抽提 一. 收核-漿蛋白 收漿蛋白 細(xì)胞計(jì)數(shù)（約1.5×107的細(xì)胞），離心收集細(xì)胞（1100rpm×5min）； 用4℃預(yù)冷的PBS重懸，轉(zhuǎn)至1.5mL的EP管中，離心（4000rpm×5min，4℃）； 去上清，加入A Buffer 1mL/1×107 cell，重懸，4℃放置10min，離心（2500rpm×3min，4℃）； 去上清，加入A’ Buffer 250uL/1.5×107 cell，重懸，4℃放置3min，離心（5000rpm×1min，4℃），吸取上清（上清是漿蛋白）； 收核蛋白 再用A’ Buffer 500uL/1.5×107 cell，重懸，4℃放置3min，離心（5000rpm×1min，4℃），吸走上清，12000rpm×30sec，把上清完全吸干凈； 剩余沉淀中加入B’ Buffer (或者RAPI)50uL，重懸（振蕩），4℃放置40min（每隔10min振蕩一次）； 離心（12000×10min，4℃），取上清即為核蛋白，－80℃保存。 Buffer A的配制： _ 終濃度 母液 配40Ml (10ml)溶液所需的量 Hepes PH 7.9 10mM 1M 400uL/(100ul) MgCl2 1.5mM 2M 30uL/(7.5ul) KCl 10mM 250mM 1.6uL/(400ul) DTT 0.5mM 0.1M 200u/(50ul) 剩余體積用ddH2O補(bǔ)足至要求體積! Buffer A’的配制： Buffer A’(2ml) = 1960ul Buffer A + 40uL 10%NP-40 + 20uL 10mg/mLPMSF + 1uL Aprotinin Buffer A’(1ml) = 980ul Buffer A + 20uL 10%NP-40 + 10uL 10mg/mLPMSF + 1uL Aprotinin Aprotinin可以用cocktail代替,而且只要核蛋白的時(shí)候可以不加 Buffer B 的配制： _ 終濃度 母液 配40Ml (10ml)溶液所需的量 Hepes PH 7.9 20mM 1M 800uL/(200ul) 甘油 25% 50％ 20mL/(5mL) NaCl 0.42M 3M 5.6mL/( 1.4mL) EDTA 0.2mM 0.5M 16uL/(4uL) DTT 0.5mM 0.1M 200uL/( 50uL) NP-40 0.2% 10％ 800uL/( 200uL) 剩余體積用ddH2O補(bǔ)足至要求體積! Buffer B’的配制： Buffer B’ = 1mL Buffer B + 10uL 10mg/mLPMSF + 0.5uL Aprotinin(可以用cockltail代替) No.7 核基質(zhì)蛋白抽提Protocol 細(xì)胞計(jì)數(shù)（約1×107的細(xì)胞），離心（1100rpm×5min）收集細(xì)胞； 用4℃預(yù)冷的PBS重懸，將細(xì)胞移至1.5ml EP管中，1×PBS洗一遍； 加300ul RIPA/1×107的細(xì)胞，裂解細(xì)胞，至冰上15-30min； RIPA＋PMSF（1：100）＋Cocktail（1：1000） 4℃預(yù)冷離心：13000rpm ×10-15min； 將離心后的上清轉(zhuǎn)移至新的已4℃預(yù)冷的1.5ml EP管，冰上備用(總蛋白)； 用１×PBS洗管底的pellet×2遍； 加入U(xiǎn)rea-Lysis buffer 10-15ul裂解pellets，vortex 10min； 4℃預(yù)冷離心：13000rpm ×10min；用BufferA 90ul稀釋，此為核基質(zhì)蛋白。 RIPA（PH 8.0）： 150mM NaCL 1% NP-40 0.5% DOC 0.1% SDS 50mM Tris Urea-Lysis buffer（PH 8.0）： 100mM NaH2PO4 10mM Tris-HCL 300mM NaCL 8M urea Buffer A： 100mM NaH2PO4 10mM Tris-HCL 300mM NaCL 1% Triton X-100 No.8 植物組織蛋白質(zhì)提取方法 根據(jù)樣品重量（1g 樣品加入3.5ml 提取液，可根據(jù)材料不同適當(dāng)加入），準(zhǔn)備提取液放在冰上。 樣品放在研缽中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上靜置（3-4 小時(shí)）。 用離心機(jī)離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 提取上清夜，樣品制備完成。 蛋白質(zhì)提取液：300ml 1Mtris-HCl（PH8） 45ml 甘油（Glycerol）75ml 聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 這種方法針對(duì)SDS-PAGE，垂直板電泳！ 或者用三氯醋酸—丙酮沉淀法，這種方法針對(duì)雙向電泳，雜質(zhì)少，離子濃度小的特點(diǎn)！當(dāng)然單向電泳也同樣適用，只是電泳的條帶會(huì)減少！ 在液氮中研磨葉片 加入樣品體積3 倍的提取液在-20℃的條件下過(guò)夜，然后離心（4℃8000rpm以上1 小時(shí)）棄上清。 加入等體積的冰浴丙酮（含0.07%的β-巰基乙醇），搖勻后離心（4℃8000rpm以上1 小時(shí)），然后真空干燥沉淀，備用。 上樣前加入裂解液，室溫放置30 分鐘，使蛋白充分溶于裂解液中，然后離心（15℃8000rpm 以上1 小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間以沒(méi)有沉淀為標(biāo)準(zhǔn)），可臨時(shí)保存在4℃待用。 用Brandford 法定量蛋白，然后可分裝放入-80℃?zhèn)溆谩?br /> 提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮 裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 滅菌的去離子水中（終體積為5ml），使用前再加入1M 的DTT65ul/ml No.9 組織：腸黏膜為例 應(yīng)用TRIPURE 提取蛋白質(zhì)步驟： 含蛋白質(zhì)上清液中加入異丙醇：（1.5ml 每1mlTRIPURE 用量）倒轉(zhuǎn)混勻，置室溫10min 離心：12000 g，10min，4 度，棄上清加入0.3M 鹽酸胍/95％乙醇：（2ml 每1mlTRIPURE 用量）振蕩，置室溫20min 離心：7500g，5 min，4 度，棄上清重復(fù)0.3M 鹽酸胍/95％乙醇步2 次沉淀中加入100％乙醇2ml充分振蕩混勻，置室溫20 min 離心：7500g，5min，4 度，棄上清吹干沉淀1％SDS 溶解沉淀 離心：10000g，10min，4 度,取上清-20 度保存（或可直接用于WESTERN BLOT） 存在的問(wèn)題：加入1％SDS 后沉淀不溶解，還是很大的一塊，4 度離心后又多了白色沉淀，SDS 結(jié)晶？測(cè)濃度，含量才1mg/ml 左右。 解決：提蛋白試劑盒，另外組織大小適中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10 分鐘，效果很好的。 No.10 細(xì)菌蛋白 用甲醇提取的，凍干后用緩沖液溶解的。樣品緩沖液是一般的。其中含又2%的SDS，20mmol 的2-巰基乙醇。 No.11 腫瘤組織 0-4°C 生理鹽水沖洗組織表面血跡，以1：9（即100ug 重量加入900ul 體積）的比例加入蛋白勻漿提取液，0-4 °C 冰水混合物中用1ml 勻漿器制成10%的蛋白勻漿。勻漿在10000G 離心10-15 分鐘，取上清備用。 注：蛋白勻漿提取液(PH7.6)：Nacl 50 mM Tris 10mM EDTA 1mM， PMSF 1 mM，Na3 VO4 .12H2O 0.5 mM NaF 50 mM Benzamidine 1 mM No.12 腦組織 將切取的組織用4℃預(yù)冷的0.01mol/l 的PBS 漂洗去血漬，再用濾紙吸干殘留的PBS，將組織稱重，將0.1G 組織放入1ml 的玻璃勻漿器，加入800l 裂解液在冰上充分勻漿，將得到的勻漿液用液氮反復(fù)凍融3 次，室溫靜置30mins，4℃ 15000r/min 離心1h，小心避開(kāi)脂層，吸取上清，分裝，-80℃保存。 裂解液配方如下： 尿素7mol/l 硫脲2mol/l CHAPS 4%(m/v) DTT 65Mmol/L(上樣前臨加) IPG Buffer 0.5%(V/V)(上樣前臨加) PMSF 2ug/l(m/V)(上樣前臨加) DNA 酶1 2ug/l(m/V)(上樣前臨加) RNA 酶A 2ug/l(m/V)(上樣前臨加) No.13 酵母蛋白的提取方法 準(zhǔn)備SD/-Leu 或是YPD 培養(yǎng)基20ml，酵母過(guò)夜培養(yǎng)，30℃，230rpm。 測(cè)OD600 約1.0。 100ml 過(guò)夜培養(yǎng)物，1000g，離心，5min，4℃。 棄上清，重懸于80ul 抽提buffer： 0.1M Tris-Cl（PH7.5），0.2M NaCl，0.01Mβ-ME，20％甘油，5mM EDTA，1mMPMSF。(100×)：PMSF 0.1742g 溶于10ml 異戊醇（主要抑制絲氨酸蛋白激酶），RT 保存。 轉(zhuǎn)移上清到一預(yù)冷的玻璃管中，再加入玻璃珠33ul（425-600um）。冰上操作，渦流10min，但不包括樣品的預(yù)冷時(shí)間。 回收玻璃珠，并盡可能取上清到另一預(yù)冷的玻璃管中。 40ul 的抽提buffer，同上渦流。 離心后分離上清（回收玻璃珠）。 液氮快速冷凍，-70℃儲(chǔ)存。 |
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