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醫(yī)學(xué)生物科研銅蟲 (小有名氣)
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[交流]
【百奧實(shí)驗(yàn)方法】侵襲遷移
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Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)介紹細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酷膜相隔，將研究的細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酷膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，應(yīng)用不司不經(jīng)和經(jīng)過不同外理的聚破酸酷膜，就可以進(jìn)行共培養(yǎng)，細(xì)胞趨化，細(xì)胞遷移，細(xì)胞侵襲等多種方面的研究。 實(shí)驗(yàn)步驟： 一、材料準(zhǔn)備可拍照顯微鏡，Transwell小室，孔徑8um，沒包被膠的(Coster和Corning公司的也較常用)，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)板24孔板。細(xì)胞培養(yǎng)板應(yīng)當(dāng)與購買的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，無血清 DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培養(yǎng)基，DMEM完全培養(yǎng)基，1640完全培養(yǎng)基(也可加到20%血清)，無菌PBS，棉簽，胰酶，甲醇，結(jié)晶紫染液(0.1%(g/ml)PBS結(jié)晶紫) 二、步驟和流程 1.基質(zhì)膠鋪板用BD公司的Matrigel1:8(根據(jù)細(xì)胞產(chǎn)生mmp的量來決定)稀釋，包被Transwel小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matriqel聚合成經(jīng)膠。使用前進(jìn)行基底膜水化。2.2制備細(xì)胞縣液1制備細(xì)胞縣液前可先讓細(xì)胞撒血清饑餓12-24h，進(jìn)一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。 2.消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，(用PBS洗1-2遍)，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重暴。調(diào)整細(xì)胞密度至5x105/m。 3.接種細(xì)胞1.取細(xì)胞縣液100u加入Transwel小室。2.24刊板下室一般加入600ul含20S的培美基，特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。3.培養(yǎng)細(xì)胞:常規(guī)培養(yǎng)12-48h(主要依癌細(xì)胞侵襲能力而定)。24h較常見，時間點(diǎn)的選擇除了要考慮到細(xì)胞細(xì)胞侵襲力外，處理因素對細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視。4.結(jié)果統(tǒng)計(jì)直接計(jì)數(shù)法，"貼壁”細(xì)胞計(jì)數(shù)，這里所謂的“貼壁”是指細(xì)胞穿過膜后，可以附著在膜的下室側(cè)而不會掉到下室里面去，通過給細(xì)胞染色，可在鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞。取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用無鈣的PBS洗2遍，甲醇固定30分鐘將小室適當(dāng)風(fēng)干。0.1%結(jié)晶紫染色20min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，用PBS洗3遍。400倍顯微鏡下隨即五個視野觀察細(xì)胞，記數(shù)。 |
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