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專業(yè): 生物大分子結構與功能

[交流] 單克隆抗體與免疫熒光染色技術

自從kohla和milsteinFTTC于1975年首創(chuàng)雜交瘤技術以來，單克隆抗體已應用于免疫學、生理生化、藥理學、組織學、腫瘤學、微生物學等不同的學科，其應用之廣、發(fā)展之快，促使醫(yī)學、生物學領域起著巨大的變革。單克隆抗體是利用細胞融合技術，在體外大量培養(yǎng)融合細胞，由融合細胞產生大量的抗體。由于單克隆抗體只識別某一特定的抗原決定簇，所以它具有特異性強、成分均一、靈敏度高、產量大、容易標準化生產等優(yōu)點而明顯優(yōu)于多克隆抗體。目前世界上己建立的單克隆抗體品種數(shù)以萬計，其中數(shù)千種已經上市.

免疫熒光技術又稱為熒光抗體染色方法，它是將血清學方法和顯微鏡示蹤方法結合起來的一種技術。這種技術是FTTCcoons等于1942FTTC年首先建立的，在醫(yī)學和生物學研究工作中的應用將近FTTC%$FTTC多年。熒光抗體法是將特異性抗原多次注入動物體，使之產生抗體，將免疫球蛋白從血清中分離出，用熒光色素標記，制成熒光標記抗體溶液，以該溶液作為特異性試劑，浸染含有特異性抗原（或抗體）的標本，借異抗原抗體的特異性，于抗原或生物學染色方法有較高的特異性和敏感性。由于免疫化學技術的進展和普及，熒光抗體染色法的應用范圍也不斷擴大。對病原微生物的鑒定、血清抗體的檢測、特別是自身免疫病的研究、腫瘤免疫與診斷以及免疫球蛋白的代謝研究均有其優(yōu)越性。

為了使單克隆抗體所要認識的目標變成可見的診斷目標，那就必須通過把放射性物質、熒光素或酶分子引入抗體等化學修飾手段來達到目的。下面就對單克隆抗體和免疫熒光染色技術的原理、影響因素等方面進行探討。

1. 基本原理FTTC

FTTC免疫動物脾臟的淋巴細胞即FTTCB淋巴細胞能夠產生特異性抗體，含有為抗免疫原抗體編碼的基因，但在體外培養(yǎng)條件下生存時間極短。而單個骨髓瘤細胞系雖可在體外長期培養(yǎng)生長，含有提供無限繁殖和分泌免疫球蛋白能力的基因，但其產生的抗體卻不具有分泌特異性免疫球蛋白的能力。將這兩類細胞融合而產生的雜交瘤細胞，一方面具有骨髓瘤細胞無限生長的能力，另一方面又繼承了免疫淋巴細胞的功能，攜帶特異信息，從而大量合成特異性抗體。

由于細胞融合時，在融合劑聚乙二醇（789）的作用下，只有少數(shù)細胞融合而形成雜交瘤細胞，因此必須通過選擇性培養(yǎng)基將大量繁殖的未融合細胞分離出來，這就是篩選過程。由于每一個免疫淋巴細胞只能對單一的抗原決定基產生特異性抗體，因此將篩選出的融合細胞通過克隆化，使其集落生長成為單克隆細胞系，就能產生大量單一的高純度抗體，這種抗體就稱為“單克隆抗體”。

1.2FTTC熒光是染料吸收一種波長的光線，發(fā)出更大波長的光線的物理學過程。處于基態(tài)的熒光色素受到紫外線或蘭紫外線光的照射而吸收足夠的能量，而使色素外層電子處于激發(fā)態(tài)。這種激發(fā)態(tài)電子給無輻射躍遷到第一能級后則隨著進一步的輻射躍遷而回落到基態(tài)。在這輻射躍遷的同時釋放能量，以可見光的輻射形式釋放，這就是熒光。其特征能量（較激發(fā)光而言）小而波長長。這是由于部分能量以無輻射形式消耗的緣故，而波長則與能量成反比。

3異硫氰酸熒光素（FITC）是目前最為廣泛應用的熒光素。在堿性條件下，TITCFTTC分子上的異硫氰基—N=S=CFTTC能與抗體蛋白分子中的游離氨基（主要是賴氨酸的—NH2FTTC和少量的末端氨基）經碳酰胺化而形成硫碳氨基鍵，結合為熒光標記抗體蛋白。1個分子的FTTCIgGFTTC有86個賴氨酸，但一般最多只能標記15-20個。因為只有未質子化的自由氨基才能與FTTCTITCFTTC起加成反應。在抗體側鏈游離氨基有賴氨酸的—NH2，谷氨酸的胍基，雜環(huán)氨基酸———FTTC組氨酸，脯氨酸和色氨酸。其中雜環(huán)氨基酸不易與FTTCTITCFTTC反應，而谷氨酸的胍基解離常數(shù)（F&FTTC為FTTC!#5FTTC4C）較賴氨酸的—?:#FTTC為�。╬kFTTC為10.53"），所以質子化的程度較賴氨酸為高，進而不易與FTTCTITCFTTC反應。

在偏堿性環(huán)境條件下賴氨酸之氨基部分未質子化，呈-NH2FTTC狀態(tài)而易于進行反應。

抗體（免疫球蛋白）可以與熒光色素相結合，而不失其抗體的免疫活性，與熒光色素相結合的抗體稱為熒光抗體。

利用熒光檢測抗體的結合有兩種不同的方法。直接免疫熒光采用已直接以熒光染料標記的抗體；而間接免疫熒光測定則是先將未標記的抗體與細胞反應，然后再用熒光染料標記的抗抗體檢測這種結合的抗體。抗抗體通常稱為第二抗體，是以用于生產單克隆抗體動物的免疫球蛋白免疫異種動物制備的。當用小鼠單克隆抗體進行間接免疫熒光測定時，第二抗體可以是兔抗小鼠免疫球蛋白或山羊抗小鼠免疫球蛋白。

對于大多數(shù)用途來說，間接免疫熒光與直接免疫熒光相比具有許多優(yōu)點，尤其是僅用一種標記的第二抗體即可檢測一系列小鼠單克隆抗體。間接法更為敏感，因為增加了被結合分子的數(shù)量。但在某些特殊場合下，例如在雙標志分析或第二抗體可能與靶細胞上的抗原交叉反應時，則寧可采用直接免疫熒光法。

2FTTC主要影響因素

免疫熒光染色方法主要是檢查、鑒定、定位和示蹤各種抗原或抗體成分。所以對標本的基本要求是抗原的形態(tài)變化盡可能地小，不溶解或不變性，原有位置不擴散或不移位。因此，對標本的處理一般速度要快、溫度要低，恒冷切片和涂片較為理想。此外，抗體溶液的FTTC-.FTTC和反應溫度越低，孵育的時間越長，一般37FTTC時需要15-20min。若要作細致觀察或者當天不能進行染色標本的觀察，可在FTTC37FTTC中過夜，但染色標本最好是當天觀察。

2.1抗體FTTC與多克隆抗體（即常規(guī)血清）比較，單抗具有理化性質的一致性。就是這種單抗的均一性，才體現(xiàn)出其應用價值，但是也存在不利的方面。那就是：在標記反應過程中（包括純化過程），單抗的失活可能性遠大于多抗的失活可能性。單抗愈純，愈易失活。均一的理化性質，就必然引起標記的均一性。由于抗體與FTTCFTTC的結合勢必引起抗體結構的改變，特別是當單抗多變區(qū)（屬FTTCNH2FTTC端的游離氨基）的結合，就顯然影響到抗體抗原的反應，甚至使抗體完全失活。比如PRV-30-2（偽狂犬單抗）的標記過程中，腹水純化液的FTTC

另外，必須采用飽和濃度的抗體，以便使熒光量受抗原密度限制，而不受單克隆抗體或第二抗體濃度的限制。通過預滴定幾個稀釋度的每一單克隆抗體或第二抗體（以肉眼或流動式細胞計數(shù)器讀數(shù)）確定抗體的最適稀釋度。當一個稀釋度呈現(xiàn)出比前一個稀釋度弱的熒光時，抗體便不再處于飽和狀態(tài)。為了防止該法固有的波動，常規(guī)使用的濃度至少應保證在FTTC#FTTC倍稀釋度時熒光強度亦不致減弱。高濃度的抗體（如腹水）有時呈現(xiàn)出前帶，這一術語用于高濃度的抗體產生陰性反應，而稀釋的抗體呈現(xiàn)陽性反應時。在進行免疫熒光測定中，由于有足夠的未結合的單克隆抗體與溶液中的標記物反應，從而阻斷了標記物于結合與細胞的抗體反應，可能會產生前帶。在這種情況下必需洗滌FTTC次。前帶可因更復雜的原因而產生，但在免疫熒光測定中不常見。

2.2 溫育時間和溫度正像大多數(shù)結合—解離平衡一樣，低溫有助于結合，而高溫有利于解離。然而在較高溫度下更迅速地達到平衡。因此，獲得最大結合的良好方法是先在FTTC37溫育，然后將溫度降至7FTTC。然而，另一個對溫度選擇有影響的因素是抗體誘導的膜表面上的抗原移位，這種移位的形式多種多樣，如抗原斑片、抗原蓋帽、抗原的細胞攝粒作用及抗原脫落，最終可能是抗原丟失（抗原調整），顯然，這是應當避免的。在整個試驗期間將細胞保持在4FTTC或加疊氮鈉，可將這些過程減少到最小限度。由于不能改變溫度以適應不同親和性抗體的需要，可能不得不改變溫育時間。對于大多數(shù)抗體來說，4溫育30min是適宜的，但在這樣的條件下，低親和性的抗體可能達不到平衡，因而需要更長的溫育時間。

2.3FTTCPRV-30-2單抗的標記過程主要是抗體賴氨酸的—氨基的反應。其pk值為10.53，當反應PH愈靠近PK值，非質子化的氨基就愈多，標記上的FTTC就愈多，見表1：

特異性染色FTTC非特異性染色主要由于過度標記所引起的，F(xiàn)TTC過多的結合，造成抗體結構的改變，增加了空間位阻，而且，F(xiàn)TTC帶負電荷，而病毒的核酸蛋白多為堿性，在染色過程的FTTC-.FTTC均為中性而帶正電荷，進而造成靜電引力的增加而出現(xiàn)非特異性的吸附。對于單抗而言，過度標記物寧可棄之不用。因為實驗表明

離子交換層析的流出物之F/P比變化不大，這也說明單抗的理化一致性。

綜上所述，我們可以看到單克隆抗體熒光標記技術將成為病毒診斷方面最為快速和準確的方法之一。

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1樓 2021-09-18 09:46:22

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