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北京艾柏森鐵蟲(chóng) (小有名氣)
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[交流]
轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定方法
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一、 從鼠尾中提取DNA 采用鼠尾基因組DNA提取試劑盒提取DNA，操作如下： 1. 剪取小鼠長(zhǎng)度為0.4-0.6cm的尾巴，放入滅菌后的離心管中，加入180μL Buffer GTT。震蕩混勻。 2. 加入20μL proteinase K，渦旋震蕩，徹底混勻。 3. 置于56℃水浴，直到組織溶液完全清澈，一般需消化6-8h，賦予過(guò)程中渦旋震蕩，使樣品均勻分離。 注意： 1） 如果賦予和渦旋震蕩后仍然有膠狀物質(zhì)，必要時(shí)過(guò)夜消化再加入20μl proteinase K消化，不會(huì)影響后續(xù)操作。 2） 如需去除RNA，可在上述步驟完成后，加入4μl濃度為100mg/μl的RNase A溶液，震蕩混勻，室溫放置5-10min。 4. 14000rpm 離心 1min，以消除未消化的類似于鼠毛等組織，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的滅過(guò)菌的離心管中。 5. 加入200μl Buffer GL，渦旋震蕩，充分混勻，加入200μl 無(wú)水乙醇，渦旋振 蕩，充分混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。 注意： 1）加入Buffer GL 和無(wú)水乙醇后要立即渦旋震蕩混勻。 2） 如果多個(gè)樣品一起操作，Buffer GL 和無(wú)水乙醇可以等比例混勻后一起加入樣品。3）加入Buffer GL 和無(wú)水乙醇后可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀，不會(huì)影響后續(xù)操作。 6. 將步驟5中所得到的溶液全部加入到已裝入收集管的吸附柱中，若以此不能加完溶液，可分多次轉(zhuǎn)入。10000rpm 離心 1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 7. 向吸附柱中加入 500μl Buffer GW1（使用前檢查是否已加無(wú)水乙醇），10000 rpm 離心 1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 8. 向吸附柱中加入 500μl Buffer GW2（使用前檢查是否已加無(wú)水乙醇），10000 rpm 離心 1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。如需進(jìn)一步提高DNA純度，可重復(fù)步驟8。 9. 12000rpm 離心 2min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以徹底晾干。 注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶促反應(yīng)（酶切，PCR等）。 10. 將吸附柱置于一個(gè)新的滅過(guò)菌的離心管中，向吸附柱的中間部位懸空加入50-200μl Buffer GE或滅菌水，室溫放置2-5min，10000rpm 離心 1min，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。注意：1）如果下游實(shí)驗(yàn)對(duì)PH值或EDTA敏感，可以用滅菌水洗脫，洗脫液的PH值對(duì)洗脫效率有很大影響，若用水作洗脫液應(yīng)保證其PH值在7.0-8.5直 接，PH值低于7.0時(shí)洗脫效率不高。 2）離心前室溫孵育5min可增加產(chǎn)量。 3）用另外的50-200μL Buffer GE或滅菌水再次洗脫可以增加產(chǎn)量。 4）如果需要提高DNA的終濃度，可以將步驟10所得的DNA洗脫液重新加至吸附膜上，重復(fù)步驟10；若洗脫體積小于200μL，可以增加DNA的終濃度，但可能會(huì)減少總產(chǎn)量。 二、PCR PCR程序設(shè)定：根據(jù)轉(zhuǎn)基因類型及引物設(shè)計(jì)而改變 設(shè)定PCR反應(yīng)體系 先在1.5ml的EP管中加入總的體系再平均分裝入各個(gè)PCR管中（一般多加兩小管的量），將移液器調(diào)到總量的1/3到1/2體積在EP管中緩慢抽吸若干次（盡量避免產(chǎn)生氣泡）以便Taq酶混合均勻，最后再在各PCR管中依次加入DNA樣品。 引 物處理方法：引物合成后，EP管上會(huì)有標(biāo)記，一般為x nmol，使用前先用12000rpm 離心 1min，加入10x μl ddH2O，渦旋振動(dòng)混勻，微型離心機(jī)離心，即可得到100μM的母液，取10μl 的母液，用ddH2O稀釋10倍，即加入90μl，混勻后即可得到10μM的引物工作液。 三、 電泳 1． 配膠：鑒定用的膠板有大、中、小3種，分別用的梳子為50、25、11齒。分別用的0.5*TBE的量為90ml、45ml、25ml。用1.5%的瓊脂糖凝膠。 2． 點(diǎn)樣：12μl的DNA，Marker加5μl。點(diǎn)樣時(shí)注意逐個(gè)點(diǎn)樣，不要點(diǎn)錯(cuò)，最好把中間的那個(gè)孔留著點(diǎn)Marker，這樣可避免點(diǎn)樣的出錯(cuò)。Marker的選擇依基因片段大小而定。 3． 跑電泳：打開(kāi)電源，150v電壓，30min左右即可。 4． 照膠：看是否有目的條帶，即可判斷對(duì)應(yīng)小鼠是陽(yáng)性、陰性或是雜合子。 5． 保存。 |
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