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[求助]
關(guān)于合成多肽降解問題 已有3人參與
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| 合成的多肽粉末在4℃冰箱存放了幾天，然后在拿出來(lái)無(wú)菌水常溫溶解測(cè)活性，這個(gè)過程肽有降解導(dǎo)致失活的可能嗎？ |
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- 專業(yè): 生物化學(xué)
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2樓2021-09-15 12:36:23
醫(yī)學(xué)生物科研
銅蟲 (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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建議先用少量肽來(lái)試驗(yàn)最適溶解方法，只有當(dāng)多肽完全溶解后，才能加入溶液并將之稀釋至最終濃度。即先溶解，后加入緩沖液。注意：總是將多肽加入到適當(dāng)溶劑中攪拌，而不能采用其它方式。 凍干多肽的溶解 多肽溶解中的主要問題是二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。 雖然疏水肽鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成更明顯，但除了最短的肽鏈外，該現(xiàn)象發(fā)生在幾乎所有肽鏈，與極性無(wú)關(guān)。因此，溶解多肽的第一個(gè)原則是用無(wú)菌的蒸餾水或去離子水 (如果條件允許則用無(wú)氧水)。 多肽溶液可能遇到細(xì)菌降解。為避免該現(xiàn)象的發(fā)生, 多肽應(yīng)溶解在無(wú)菌的蒸餾水中, 或者用 0.45 或 0.2 μm 孔徑的濾膜過濾除菌。 包含 Cys、Met、Trp 的多肽特別容易氧化, 因此應(yīng)該溶于無(wú)氧的水中。無(wú)氧水可以通過注入惰性氣體 (氮、氦、氬) 減壓除氣得到。 若多肽不溶于純水，超聲處理有助于打碎顆粒并增加溶解度。注意: 超聲處理會(huì)引起溶液發(fā)熱和多肽降解。 若多肽中包含多個(gè)堿性氨基酸，使用（1-10%）的乙酸水溶液；對(duì)于疏水性非常強(qiáng)的多肽，則使用 50% 乙酸。 若多肽中含有大量酸性氨基酸，可用氨溶液（1-10%）或乙酸乙基嗎-啡或重碳酸鹽等揮發(fā)性的堿性緩沖液溶解。pH 值在層析前必須調(diào)整。 異-丙醇和乙-腈能溶解中等大小的肽。若肽要上柱，有機(jī)溶劑的量則必須很少，否則將嚴(yán)重影響停留時(shí)間。 若多肽因?yàn)楹?Val、Leu、Met、Phe、Tyr、Ala 等芳烴側(cè)鏈而高度疏水，或?yàn)橹行噪臅r(shí), DMF 或 DMSO 等膜變性劑的使用，有助于多肽的溶解。 高濃度膜變性劑通過破壞多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)而助溶。 膜變性劑適于多肽分析液的制備, 但可能會(huì)對(duì)其生物活性的研究工作造成干擾。 DMF 是最佳變性劑 (最高濃度可達(dá) 30%), 滴加至多肽溶解。 反相層析時(shí), DMF 將與洗脫液前峰一起流出, 依注入量的多少, 峰值可能很高。大多數(shù)肽能在大量 DMF 流出后幾分鐘內(nèi)流出, 若肽鏈很小, 洗脫太早, 多肽的量將降低。 凍干多肽的保存 所有標(biāo)明「保持凍干」的產(chǎn)物, 都必須保存在冰凍條件下，最好 -20℃，若保存在 -80℃ 以下, 大多數(shù)肽可維持幾年的活性。 當(dāng)使用冰凍產(chǎn)品時(shí), 開蓋之前, 瓶或試管應(yīng)在裝有新鮮干燥劑的干燥箱內(nèi)升至室溫。對(duì)于保存于 -20℃ 的產(chǎn)品, 這個(gè)過程需要一小時(shí)或更長(zhǎng), 隨包裝大小而異。否則, 當(dāng)瓶打開時(shí), 水氣進(jìn)入導(dǎo)致多肽凝縮而降低其穩(wěn)定性。一旦打開, 應(yīng)迅速稱量完畢, 并立即密閉以免潮解, 尤其親水肽更應(yīng)注意。 多肽溶液的保存 多肽溶液比干粉的穩(wěn)定性差很多, 為了得到最好結(jié)果, 遵循下列原則： 反復(fù)凍融有損于肽的活性, 所以建議分裝成小包裝保存。需要多少解凍多少, 用后剩余者棄掉。 溶于 pH5-7 無(wú)菌的緩沖液中, 貯存于 -20℃。 包含 Cys、Met、Typ、Glu、Asp 的多肽易于氧化, 因此須保存在無(wú)氧化劑的環(huán)境中。 由于細(xì)菌能降解多肽, 因此貯存前必須過濾除菌。 |
3樓2021-09-15 14:08:14
4樓2021-09-16 16:09:26
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