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北京艾柏森鐵蟲 (小有名氣)
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[交流]
質(zhì)粒DNA提取實(shí)驗(yàn)
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在我們的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常會用到質(zhì)粒DNA，那么具體是怎么來的呢？今天講的是DNA的提取步驟，各位接好了喲~~前提細(xì)菌繁殖步驟（挑單克隆，置于LB培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床搖過夜，180-200 rpm）。 一般市面上有很多試劑盒可供大家使用，大體步驟都差不多的啦~~我按照我所使用的試劑盒（AxyPrep中抽試劑盒）的步驟分享如下： 收集1. 50 ml離心管收集過夜搖菌的LB培養(yǎng)液（此時可以做一下判斷，如果液體未變渾濁，說明細(xì)菌并未繁殖成功，這樣肯定難以提出DNA；如果液體渾濁，便說明細(xì)菌繁殖成功啦，可繼續(xù)下面的操作）,6000 g離心8 min，棄上清。 裂解2. 加250 μl Buffer S1 重懸細(xì)菌的沉淀，可以在渦旋儀上渦旋，使得沉淀全部重懸均勻，不留有小的菌塊。 3. 加250 μl Buffer S2，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)4-6次混合均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步驟不宜超過5 min。 中和4. 加350 μl Buffer S3，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合6-8次，12,000×g離心10 min。 5. 質(zhì)粒DNA制備管插到負(fù)壓裝置的接口上。吸取步驟4中的離心上清并轉(zhuǎn)移到制備管中， 開啟并調(diào)節(jié)負(fù)壓至-20-30英寸汞柱，緩慢吸走管中溶液。 結(jié)合6. 加500 μl Buffer W1，吸盡管中溶液。 7. 加700 μl Buffer W2，吸盡管中溶液；以同樣的方法再用700 μl Buffer W2 洗滌一次。 洗滌8. 將制備管置于2 ml離心管（試劑盒內(nèi)提供）中，12,000×g離心1 min。 洗脫9. 將制備管移入新的1.5 ml離心管（試劑盒內(nèi)提供）中，在制備管膜中央加60-80 μl Eluent或去離子水，室溫靜置1 min。12,000×g離心1 min。 將Eluent或去離子水加熱至65℃將提高洗脫效率。10. 最后去檢測其濃度即可啦。 之前也用過其他的試劑盒，步驟大同小異，根據(jù)說明書步驟操作就可以了，這個實(shí)驗(yàn)比較簡單的啦。 |
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