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科研bxnb新蟲 (初入文壇)
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原創(chuàng)筆記：小談流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 已有1人參與
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正常細(xì)胞中的磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine, PS)位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè),在細(xì)胞發(fā)生凋亡時PS會從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面即暴露在細(xì)胞的外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量在35～36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白,與PS有極高高親和力可以與之發(fā)生特異性結(jié)合,將Annexin-V進(jìn)行熒光素(FITC)標(biāo)記成Annexin-V-FITC探針,用該探針標(biāo)記待檢測細(xì)胞,利用流式儀通過檢測FITC信號即可反應(yīng)帶警車細(xì)胞的凋亡情況。 當(dāng)然對于現(xiàn)有的凋亡檢測試劑并沒有滿足于整體凋亡情況的反映,一般的試劑會結(jié)合碘化丙啶(propidine iodide, PI)進(jìn)行更細(xì)層面的檢測。PI是一種核酸染料,它不能透過完整的細(xì)胞膜,但在凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞細(xì)胞膜一般會發(fā)生破裂,此時PI能夠細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi),嵌入到DNA中,使細(xì)胞核釋放紅色熒光。 在操作過程中,不論是分離組織細(xì)胞或是收集培養(yǎng)中的細(xì)胞,需盡量避免污染,一般收集1×106的細(xì)胞制備成1mL的細(xì)胞懸液按照凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作即可,但一定要注意整個過程需要輕柔操作,以免造成細(xì)胞是寫損傷而影響檢測結(jié)果。探針孵育完成后需在1小時以內(nèi)完成檢測,另外上機檢測時記得配上不做任何標(biāo)記的陰性對照管哦。 對于實驗結(jié)果首先我們需要在細(xì)胞自身光散射特性方面進(jìn)行評判。凋亡細(xì)胞形態(tài)上的改變影響它們的光散射特性。在流式細(xì)胞儀上,前向散射光與細(xì)胞的大小有關(guān),而側(cè)向散射光反映的是光在細(xì)胞內(nèi)的折射作用,與細(xì)胞內(nèi)的顆粒多少有關(guān)。在細(xì)胞凋亡時,細(xì)胞固縮,體積變小,故前向散射光降低,這一特性往往被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的特點之一。此外細(xì)胞凋亡時由于染色體降解,核破裂形成,細(xì)胞內(nèi)顆粒往往增多,故凋亡細(xì)胞側(cè)向散射光常增加。細(xì)胞壞死時,由于細(xì)胞腫脹,其前向散射光增大;側(cè)向散射光在細(xì)胞壞死時也增大,因此可根據(jù)前向散射光和側(cè)向散射光區(qū)別凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。但需要注意的是,根據(jù)前散射光和側(cè)向散射光判斷凋亡細(xì)胞的可靠性受被檢測細(xì)胞形態(tài)上的均一性和核胞漿比率影響很大。因此我們必須要進(jìn)行凋亡因子的直接反映。 前面我們提到凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞由于其細(xì)胞膜損傷,PI能夠穿透細(xì)胞膜而嵌入DNA中,是細(xì)胞核產(chǎn)生紅色熒光。而細(xì)胞膜保持完好的早期凋亡細(xì)胞對于細(xì)胞活性鑒定的染料PI有抗染性,則不會有紅色熒光產(chǎn)生,正�；罴�(xì)胞與之相似。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點圖上,所呈現(xiàn)的結(jié)果即為:左上象限顯示機械損傷細(xì)胞,為(FITC-/PI+);左下象限顯示活細(xì)胞,為(FITC-/PI-);右上象限是非活細(xì)胞,即壞死細(xì)胞或晚期凋亡細(xì)胞,為(FITC+/PI+);而右下象限為早期凋亡細(xì)胞,呈現(xiàn)(FITC+/PI-)。 最后提醒一下想要做流式凋亡檢測結(jié)果統(tǒng)計的科研汪們,由于用流式檢測凋亡時,PI受時間的影響很大,因為標(biāo)記了PI后會加大細(xì)胞毒性,隨著時間延長會導(dǎo)致PI的染色增加,特別是檢測早期凋亡時,如果時間延長除了會導(dǎo)致在流式細(xì)胞儀上的細(xì)胞分群差距加大外,誤差會明顯加大。根據(jù)以前做流式凋亡時的經(jīng)驗,建議每組實驗一次可以先做三個復(fù)孔,上機前5分鐘加PI,最好在半小時內(nèi)檢測完畢。這時可以先分析下三個復(fù)孔的差異。等待摸索的實驗條件成熟后,每組實驗一次可以做6~8個復(fù)孔,然后做統(tǒng)計學(xué)分析。嚴(yán)格說來,當(dāng)做出統(tǒng)計學(xué)差異時,這樣的實驗還要重復(fù)三次。但是因檢測凋亡時,受細(xì)胞狀態(tài),PI染色時間,流式檢測時間,以及每次實驗時的誤差等的影響外,很難保證能夠完全重復(fù)出上次的結(jié)果,甚至即使在保證了實驗條件幾乎相同的情況下,每次重復(fù)的差異也會出現(xiàn)加大的情況。這時可以適當(dāng)重復(fù)2~3次,盡量使差異減小。 |
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2樓2021-09-10 15:15:57
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