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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 生物科學 » 免疫實驗 » 實驗經驗-多肽的溶解和保存
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醫(yī)學生物科研銅蟲 (小有名氣)
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實驗經驗-多肽的溶解和保存
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建議先用少量肽來試驗最適溶解方法，只有當多肽完全溶解后，才能加入溶液并將之稀釋至最終濃度。即先溶解，后加入緩沖液。注意：總是將多肽加入到適當溶劑中攪拌，而不能采用其它方式。 凍干多肽的溶解 多肽溶解中的主要問題是二級結構的形成。 雖然疏水肽鏈二級結構的形成更明顯，但除了最短的肽鏈外，該現象發(fā)生在幾乎所有肽鏈，與極性無關。因此，溶解多肽的第一個原則是用無菌的蒸餾水或去離子水 (如果條件允許則用無氧水)。 多肽溶液可能遇到細菌降解。為避免該現象的發(fā)生, 多肽應溶解在無菌的蒸餾水中, 或者用 0.45 或 0.2 μm 孔徑的濾膜過濾除菌。 包含 Cys、Met、Trp 的多肽特別容易氧化, 因此應該溶于無氧的水中。無氧水可以通過注入惰性氣體 (氮、氦、氬) 減壓除氣得到。 若多肽不溶于純水，超聲處理有助于打碎顆粒并增加溶解度。注意: 超聲處理會引起溶液發(fā)熱和多肽降解。 若多肽中包含多個堿性氨基酸，使用（1-10%）的乙酸水溶液；對于疏水性非常強的多肽，則使用 50% 乙酸。 若多肽中含有大量酸性氨基酸，可用氨溶液（1-10%）或乙酸乙基嗎-啡或重碳酸鹽等揮發(fā)性的堿性緩沖液溶解。pH 值在層析前必須調整。 異-丙醇和乙-腈能溶解中等大小的肽。若肽要上柱，有機溶劑的量則必須很少，否則將嚴重影響停留時間。 若多肽因為含有 Val、Leu、Met、Phe、Tyr、Ala 等芳烴側鏈而高度疏水，或為中性肽時, DMF 或 DMSO 等膜變性劑的使用，有助于多肽的溶解。 高濃度膜變性劑通過破壞多肽的二級結構而助溶。 膜變性劑適于多肽分析液的制備, 但可能會對其生物活性的研究工作造成干擾。 DMF 是最佳變性劑 (最高濃度可達 30%), 滴加至多肽溶解。 反相層析時, DMF 將與洗脫液前峰一起流出, 依注入量的多少, 峰值可能很高。大多數肽能在大量 DMF 流出后幾分鐘內流出, 若肽鏈很小, 洗脫太早, 多肽的量將降低。 凍干多肽的保存 所有標明「保持凍干」的產物, 都必須保存在冰凍條件下，最好 -20℃，若保存在 -80℃ 以下, 大多數肽可維持幾年的活性。 當使用冰凍產品時, 開蓋之前, 瓶或試管應在裝有新鮮干燥劑的干燥箱內升至室溫。對于保存于 -20℃ 的產品, 這個過程需要一小時或更長, 隨包裝大小而異。否則, 當瓶打開時, 水氣進入導致多肽凝縮而降低其穩(wěn)定性。一旦打開, 應迅速稱量完畢, 并立即密閉以免潮解, 尤其親水肽更應注意。 多肽溶液的保存 多肽溶液比干粉的穩(wěn)定性差很多, 為了得到最好結果, 遵循下列原則： 反復凍融有損于肽的活性, 所以建議分裝成小包裝保存。需要多少解凍多少, 用后剩余者棄掉。 溶于 pH5-7 無菌的緩沖液中, 貯存于 -20℃。 包含 Cys、Met、Typ、Glu、Asp 的多肽易于氧化, 因此須保存在無氧化劑的環(huán)境中。 由于細菌能降解多肽, 因此貯存前必須過濾除菌。 |
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