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蟲兒飛飛小新蟲 (初入文壇)
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干貨干貨！一篇文章帶你get蛋白質(zhì)樣品制備方法-百泰派克生物科技分享 已有1人參與
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在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，蛋白樣品的制備是整個(gè)研究的第一步也是關(guān)鍵一步，直接影響到蛋白質(zhì)組研究結(jié)果。目前沒(méi)有一種蛋白質(zhì)樣品制備方法能適用于所有的生物材料，因此在實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)針對(duì)不同的材料和研究目的（比如是要提取出盡可能多的蛋白質(zhì)還是僅僅捕獲感興趣的目標(biāo)蛋白）選擇適宜的蛋白質(zhì)樣品制備方法。 蛋白質(zhì)樣品的制備包括以下步驟：1. 樣品的破碎與裂解; 2. 蛋白質(zhì)的沉淀; 3. 蛋白質(zhì)組分的純化 一. 樣品的破碎與裂解 1. 機(jī)械破碎法： （1）研磨法——常用于固體材料或組織材料的破碎；將剪碎的組織材料至于研缽或勻漿器中，加少適量石英砂研磨成勻漿�；蛘呦扔靡旱A(yù)冷研缽，然后將冷凍保存于液氮中的組織研磨成粉狀。 （2）組織搗碎法——常用于固體材料或組織材料的破碎；用家用食品加工機(jī)將組織打碎，然后用內(nèi)刀式組織搗碎機(jī)以10000~20000r/min的轉(zhuǎn)速破碎細(xì)胞，通常搗碎10~20s暫停10~20s，反復(fù)多次。 2. 物理破碎法： （1）超聲波處理法——常用于組織培養(yǎng)的細(xì)胞破碎；利用超聲波的振動(dòng)力來(lái)破碎細(xì)胞，操作時(shí)應(yīng)采用間斷式超聲，防止樣品過(guò)熱導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解。 （2）反復(fù)凍融法——常用于細(xì)菌或組織培養(yǎng)的細(xì)胞破碎；將待破碎的細(xì)胞冷卻至-15~-20℃，然后在室溫或40℃下迅速融化，如此反復(fù)多次。 （3）冷熱交替法——常用于細(xì)菌或病毒蛋白質(zhì)提��；將樣品在90℃溫浴數(shù)分鐘，立即轉(zhuǎn)至冰浴，反復(fù)多次。 3. 化學(xué)與生物化學(xué)法： （1）有機(jī)溶劑處理法——常用于動(dòng)物細(xì)胞；利用氯仿、甲苯、丙酯等脂溶性溶劑或十二烷基硫酸鈉（SDS）等表面活性劑處理細(xì)胞，使細(xì)胞破碎，釋放內(nèi)含物。 （2）酶解法——常用于真菌或放線菌一類的微生物細(xì)胞；根據(jù)樣品選用合適的酶和反應(yīng)條件進(jìn)行酶解獲得細(xì)胞裂解液。 （3）滲透壓沖擊法——適用于沒(méi)有細(xì)胞壁的動(dòng)物細(xì)胞；將待破碎細(xì)胞置于高滲溶液中，再轉(zhuǎn)移到低滲溶液或水中，使細(xì)胞吸水脹破釋放內(nèi)含物。 二. 蛋白質(zhì)的沉淀 蛋白質(zhì)的沉淀就是從獲得的細(xì)胞提取液中選擇性的分離、濃縮蛋白質(zhì)，這里介紹幾種常用的蛋白質(zhì)沉淀方法： 1. 鹽析法：①用＞50mmol/L的EDTA溶液處理細(xì)胞裂解液，使蛋白質(zhì)最終濃度大于1mg/mL；②加入硫酸銨至所需要的濃度，攪拌10~30min，離心沉淀蛋白質(zhì)；③利用透析、超濾或脫鹽柱等方法去除殘留的硫酸銨雜質(zhì)。 2. 有機(jī)溶劑沉淀法： （1）三氯醋酸（TCA）沉淀法：①將TCA加到提取液中，使其終濃度高達(dá)10%~20%；②冰上沉淀30min；③離心收集沉淀，用乙醇或丙醇洗去殘留的TCA。 （2）丙酮沉淀法：①在提取液中加入3倍體積的丙酮，-20℃處理2h；②離心收集沉淀，空氣干燥或冷凍干燥去除殘留的丙酮。 （3）TCA/丙酮沉淀法：①將提取液置于含有20mmol/L的二硫蘇糖醇（DTT）或0.07%巰基乙醇的10%的TCA溶液中，-20℃處理45min；②離心收集沉淀，用含20mmol/L的二硫蘇糖醇（DTT）或0.07%巰基乙醇的預(yù)冷的丙酮溶液進(jìn)行清洗；③空氣干燥或冷凍干燥去除殘留的丙酮。 （4）苯酚提取法：①在提取液中分別加入1.5倍體積的苯酚和酚提取液，5000r/min離心10min，收集上清液；②加入1倍體積的酚提取液，5000r/min離心10min，收集上清液；③ 加入0.2倍體積的甲醇溶液，-70攝氏度保存過(guò)夜；④離心，清洗沉淀，加入200ul的甲醇溶液，再次離心去上清；⑤重復(fù)上一步驟，向沉淀中加入80%的丙酮200ul，離心收集沉淀，并保存在-4℃?zhèn)溆谩?br /> 3. 聚乙二醇（PEG）沉淀法：①100mL提取液中加入100~150mL50%的PEG溶液，緩慢攪拌60min，至沉淀完全；②離心收集蛋白質(zhì)沉淀。 三. 蛋白質(zhì)的純化 經(jīng)分離的蛋白質(zhì)樣品常常含有一些非蛋白類雜質(zhì)，如核酸、多糖、色素、去污劑、代謝物等，可以通過(guò)以下方法去除，純化蛋白樣品。 1. 核酸沉淀法去除核酸：①在蛋白樣品中加入少量脫氧核糖核酸酶，4℃保溫0.5~1h；②離心去除沉淀，收集蛋白上清液。 2. 抑制劑去除多酚類物質(zhì)：植物組織多含有酚類物質(zhì)，在細(xì)胞破碎過(guò)程中加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）可以吸收酚類物質(zhì)。 3. 透析法去除鹽離子：通常采用透析法去除樣品中的鹽離子，透析脫鹽非常有效，透析可能會(huì)造成蛋白樣品的濃度降低，可以通過(guò)真空濃縮增加其濃度；此外，還可以通過(guò)凝膠層析、沉淀/重溶的方法進(jìn)行脫鹽處理。 樣品制備過(guò)程中還需要特別注意以下問(wèn)題： 1. 保證蛋白質(zhì)完全溶解；2. 避免蛋白質(zhì)發(fā)生降解或變性；3. 去除雜質(zhì)的干擾；4. 最終獲得的蛋白樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融。 |
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默默墨魚丸
新蟲 (初入文壇)
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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請(qǐng)問(wèn)為什么在硫酸銨沉淀的時(shí)候需要加入50mM EDTA呢？我們一般文獻(xiàn)寫的提取蛋白都是5-10mM吖 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2021-09-05 10:58:38
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