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醫(yī)學(xué)生物科研銅蟲 (小有名氣)
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免疫組化實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn)，新手快速入門必看！-百奧思科
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免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)是一門利用酶、熒光素、生物素、重金屬離子等作為示蹤劑，通過免疫親和（抗原抗體特異性結(jié)合），在組織切片或細(xì)胞薄片上原位顯示追蹤生物體內(nèi)大分子物質(zhì)動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的實(shí)用性染色技術(shù)。按其主要示蹤原理可以分為免疫組化（默認(rèn)酶標(biāo)法）、免疫熒光法、膠體金法等。 作用：通過顏色來顯示蛋白質(zhì)的有無、定位（胞外、胞膜、胞漿、胞核）、含量變化 樣本種類： 按來源：①組織；②培養(yǎng)細(xì)胞 按制作方式：①石蠟片（IHC-P）②冰凍片（IHC-F）③細(xì)胞片（ICC） BOSTER 03/免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟解析 01 取材 快：盡量半小時(shí)內(nèi)取材完成 準(zhǔn)：刀、剪鋒利，一步到位，輕夾輕放 大�。�1cm X 1cm X 0.2cm左右最宜 02 固定 何時(shí)固定？ 取材后立刻！馬上！ 用什么固定？ 4%多聚甲醛或福爾馬林較通用。有致密外膜用Carnoy液，活檢用Bouin液 固定液用多少？ 組織體積20倍以上最宜。量少應(yīng)中途換液1-3次 固定多久？ 6-24h最佳。固定后盡快包埋成蠟塊（蠟塊可保存幾年時(shí)間而不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果），固定越久所需修復(fù)強(qiáng)度越大，越容易出現(xiàn)自發(fā)熒光及非特異性染色。 03 切片 要保存簡單 ——選石蠟片 ! 要速度快 ——選冰凍片！ 要結(jié)構(gòu)漂亮 ——選石蠟片！ 抗原不穩(wěn)定 ——選冰凍片！ 抗原穩(wěn)定 ——石蠟片冰凍片皆可！ 04 烤片 切多厚？ 石蠟片3-8μm，一般5μm；冰凍片5-15μm，一般8μm 石蠟片怎么撈片？ 水溫40-45℃，組織平整后玻片有油漆的一面貼近組織向斜上方提起 烤多久？ 37℃過夜 或 60℃ 1-2h 注意：使用防脫處理的玻片，冰凍片無需烤片 05 脫蠟至水 Step1：二甲苯（7min） Step2：二甲苯（7min） Step3：二甲苯（7min） Step4：100%酒精（7min） Step5：85%酒精（7min） Step6：70%酒精（7min） 注：具體脫蠟時(shí)間可結(jié)合室溫做調(diào)整，以組織上的石蠟脫干凈為準(zhǔn)。 06 滅活 ➊ 一般組織使用3%H₂O₂，室溫孵育10min ❷ 內(nèi)源性過氧化物酶在血管瘤、肝、胎盤、闌尾炎，壞死區(qū)域和急性炎癥組織含量較高，這樣的組織可以適當(dāng)延長滅活時(shí)間 ❸ 顯色系統(tǒng)為過氧化物酶（HRP）系統(tǒng)，該步驟建議一定要做 ❹ 堿性磷酸酶（AP）系統(tǒng)以及免疫熒光，該步驟可以不做 ❺ 在滅活時(shí)，如組織片中出現(xiàn)細(xì)小且密集的氣泡，表示過氧化物酶含量過高，這時(shí)用3%H₂O₂溶液難以完全阻斷，可以用0.5%高碘酸溶液室溫條件孵育10min 07 抗原修復(fù) 抗原修復(fù)方式： 酶修復(fù)、高壓熱修復(fù)、微波熱修復(fù)。微波熱修復(fù)一般都能得到很好的效果 修復(fù)液的選擇： 檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0）和EDTA（PH8.0或9.0）。經(jīng)驗(yàn)證，對于大多數(shù)的抗體來說后者使用效果更優(yōu) 修復(fù)強(qiáng)度的選擇： 固定時(shí)間越久，修復(fù)強(qiáng)度越強(qiáng)，舊標(biāo)本修復(fù)強(qiáng)度強(qiáng)于新鮮標(biāo)本 消化酶的使用： 不同的蛋白有最佳的消化酶，使用中要注意各種消化酶的最佳PH值 08 封閉 ➊ 5%BSA最常用 ❷ 血清，效果最全面 ❸ 封閉血清與二抗同源（比如二抗是山羊抗小鼠IgG，封閉液選擇山羊血清），與一抗不能同源 09 抗體孵育 ➊ 單抗和多抗各有優(yōu)勢，按需選用 ❷ 一抗4℃孵育效果最佳，備選37℃ 1-2h ❸ 二抗需與一抗的種屬、類別或亞類相匹配，推薦驢、山羊、綿羊等種屬 ❹ 二抗/SABC 一般 37℃ 孵育30 min 10 顯色 ➊ DAB顯色液現(xiàn)用現(xiàn)配 ❷ 建議鏡下控制反應(yīng)時(shí)間 ❸ 根據(jù)顯色時(shí)間的長短反向優(yōu)化前期的實(shí)驗(yàn)條件 11 復(fù)染/返藍(lán) ➊ Mayer`S 蘇木素復(fù)染（不易過染） ❷ 堿性溶液浸泡返藍(lán)（如氨水、飽和磷酸氫二鈉溶液等） ❸ 免疫熒光實(shí)驗(yàn)可選用DAPI等核染料復(fù)染細(xì)胞核，無需做返藍(lán) 12 脫水透明 Step1：70%酒精（3min） Step2：85%酒精（3min） Step3：100%酒精（3min） Step4：二甲苯（3min） Step5：二甲苯（3min） Step6：二甲苯（3min） 注：免疫熒光實(shí)驗(yàn)，該步驟可以不做。 13 封片 ➊ DAB顯色用中性樹膠封片 ❷ 免疫熒光建議用抗熒光衰減封片劑 ❸ AEC顯色用水溶性封片劑 BOSTER 04/博士德組化檢測結(jié)果圖 GFAP （PB0046）小鼠腦組織石蠟切片，稀釋比1：200，二抗為Cy3-羊抗兔IgG（BA1032），稀釋比1：100，DAPI（AR1176）染核。 Vimentin （BM0135）人直腸癌石蠟切片，一抗稀釋比1：200，二抗為Cy3-羊抗小鼠IgG（BA1031），稀釋比1：100，DAPI（AR1176）染核。 Lamin B1（PB0640）MCF-7細(xì)胞，稀釋1：100，二抗為DyLight®488-羊抗兔IgG（BA1127），稀釋比1：200，DAPI（AR1176）染核。 E-cadherin(PB0583)人胎盤石蠟切片，SABC法（SA1022），DAB顯色（AR1022）VWF(PB0086)人肺癌石蠟切片，SV兩步法SV0002），DAB顯色（AR1022）。Lamin-A/C(PB0307)人乳腺癌石蠟切片，SV兩步法（SV0002），DAB顯色（AR1022） |
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