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木杉1123新蟲(chóng) (初入文壇)
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[交流]
畢赤酵母蛋白表達(dá)不出來(lái)… 已有6人參與
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求助各位蟲(chóng)友們，我的畢赤酵母GS115+載體ppic9k，蛋白大小不到20kD，前面的步驟都做的沒(méi)問(wèn)題，也進(jìn)過(guò)核酸電泳驗(yàn)證過(guò)了，可是到了蛋白表達(dá)這一步，就是不表達(dá)… 跑蛋白電泳 1，濃度太低，直接跑基本沒(méi)東西。試過(guò)TCA和PEG濃縮之后，條帶與空白對(duì)照沒(méi)有相應(yīng)條帶。 2，經(jīng)過(guò)鎳柱純化之后基本沒(méi)有了…這樣應(yīng)該就是沒(méi)有表達(dá)出來(lái)了。也用考馬斯檢測(cè)的試了一下，基本藍(lán)色程度很低，說(shuō)明蛋白不多。 基本新手，實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有人做過(guò)相應(yīng)的內(nèi)容，問(wèn)了很多朋友，但是做的東西不太一樣，想請(qǐng)教一下朋友們這下要怎么辦呢，感激不盡 ps：調(diào)整pH的方法還在做，周期較長(zhǎng)，換菌種載體什么的也不太清楚是否可以表達(dá)… 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
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木杉1123
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感謝回復(fù) 今天最新一批才剛剛發(fā)酵出來(lái)，調(diào)整了ph之后效果還是一樣，破菌之后倒是出現(xiàn)了其他的情況，剛跑出來(lái)的附圖如下，wb因?yàn)橥耆粫?huì)所以還在學(xué)…不知道這個(gè)算是有還是沒(méi)有，目的條帶大小應(yīng)該是17kd左右。 maker是14.4到97.4kD的 左邊三個(gè)是空白和兩組實(shí)驗(yàn)組TCA濃縮后的上清 右邊三個(gè)是破菌之后TCA濃縮后的空白和兩組 麻煩兄弟指導(dǎo)指導(dǎo)這是出來(lái)還是沒(méi)出來(lái)呀，謝謝 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
3樓2021-08-25 15:39:22
abcjlm
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6樓2021-08-26 17:24:25
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2樓2021-08-24 08:55:36
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建議先做做畢赤酵母胞內(nèi)表達(dá)。 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
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4樓2021-08-25 18:48:06
木杉1123
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感謝回復(fù) 順便請(qǐng)教一下，胞內(nèi)表達(dá)是要去除信號(hào)肽或者換菌株嗎。最新一批電泳還沒(méi)跑… 總感覺(jué)很無(wú)奈…前面幾步做的都沒(méi)問(wèn)題，pcr驗(yàn)證和高拷貝都做的不錯(cuò)…就是表達(dá)出問(wèn)題…心煩 現(xiàn)在好像沒(méi)法發(fā)圖片 上個(gè)電泳圖發(fā)不出來(lái) 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
5樓2021-08-25 20:42:49
yuso
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我也是跟你一樣的問(wèn)題 gs115 x33 載體ppiczaA 特征與你一直 蛋白帶與酶活都是自欺欺人式表征。。。同求解決辦法  發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶(hù)端 |
7樓2021-08-26 18:20:25
12zhangjie
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我也有同樣的問(wèn)題 8樓2021-09-06 08:48:20
好孩子壞孩子
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9樓2021-10-08 12:21:25
多加辣
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10樓2021-12-09 16:09:09
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