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北京艾柏森鐵蟲 (小有名氣)
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【干貨分享】噬菌體的分離與純化
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實(shí)驗(yàn)原理 噬菌體感染宿主細(xì)胞后，其DNA(或RNA)在細(xì)胞體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，相關(guān)基因表達(dá)，裝配成完整的噬菌體顆粒，最后裂解宿主細(xì)胞或通過擠出方式從宿主細(xì)胞(宿主細(xì)胞不被殺死，如M1噬菌體)中釋放出來。因此，①在液體培養(yǎng)基中可使渾濁的菌懸液變?yōu)榍辶粱蜉^清亮。利用噬 菌體的這種特性，在樣品中加入敏感菌株與液體培養(yǎng)基混合后培養(yǎng)，噬菌體便能大量增殖，釋放，從而可分離到特定的噬菌體。②在有宿主細(xì)菌生長(zhǎng)的軟瓊脂平板上，噬菌體可裂解細(xì)菌或限制被染細(xì)菌的生長(zhǎng)，形成透明的或渾濁的空斑，亦稱噬菌斑。--個(gè)噬菌體產(chǎn)生一個(gè)噬菌斑，利用這種現(xiàn)象可將分離獲得的噬菌體進(jìn)行純化。 三、實(shí)驗(yàn)用具及材料 1.菌種:大腸桿菌 2.試劑:氯仿 3.培養(yǎng)基: 液體牛肉膏培養(yǎng)基:胰蛋白胨2g，牛肉膏0.6 g,NaCl 1g，加H20至200mL，pH7. 4，121 °C20min 高壓滅菌。 3X牛肉膏培養(yǎng)液:胰蛋白陳3g，牛肉膏0. 9g,NaCl 1.5g， 加H20至100mL，pH7. 4，121 °C20min 高壓滅菌。 固體牛肉膏培養(yǎng)基:每100mL液體牛肉膏培養(yǎng)基加入1.5g瓊脂粉，121 °C20min高壓滅菌。 半固體牛肉膏培養(yǎng)基:每100mL液體牛肉膏培養(yǎng)基加入0. 7g瓊脂粉，121 °C20min高壓滅菌。 4.儀器及其他用品:無菌小試管、無菌吸管、玻璃涂棒、無菌細(xì)菌過濾器(孔徑0.22um)，恒溫水浴鍋等。 5. 陰溝污水 四、實(shí)驗(yàn)步驟 1.噬菌體的分離 (1)制備菌懸液:用接種環(huán)在斜面.上挑取少許大腸桿菌菌苔接入盛有5mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液的試管中,混合均勻后置37°C培養(yǎng)過夜 (2)增殖培養(yǎng):在盛有10mL3倍牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基大的三角燒瓶中加入陰溝污水20mL和大腸桿菌過夜培養(yǎng)物0.3mL，混合后置37C振蕩培養(yǎng)12~24h (3)制備裂解液:將上述混合培養(yǎng)物倒入一支50mL無菌離心管中，經(jīng)4000r/min離心15min;將上清液小心的轉(zhuǎn)入另一無菌離心管中，所得裂解液經(jīng)37°C培養(yǎng)過夜，以作無菌檢查，此為噬菌體裂解液;還可加入幾滴氯仿，稍作混合，備用 (4) 噬菌體檢測(cè):在牛肉膏蛋白胨瓊脂平板.上加入0.1mL大腸桿菌菌液，用無菌玻璃涂棒將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面.上。待平板菌液干后分別滴加數(shù)小滴裂解液于其上，置37°C培養(yǎng)過夜。如果滴有裂解液處形成無菌生長(zhǎng)的透明或渾濁噬菌斑，便證明裂解液中有大腸桿菌噬菌體 2. 噬菌體的純化 (1)取_上經(jīng)證實(shí)的噬菌體裂解液0.1mL于- -支無菌試管中，再加入0.1mL新鮮的大腸桿菌培養(yǎng)物，混合均勻; (2)取_上層瓊脂培養(yǎng)基溶化并冷卻至55°C (可預(yù)先溶化后置50~55°C水浴鍋內(nèi)保溫備用)，加入0.2mL上述噬菌體與細(xì)菌的混合物，混勻后快速倒入含地層培養(yǎng)進(jìn)的平板上，鋪勻，置37°C培養(yǎng)24h; (3)取出培養(yǎng)的平板仔細(xì)觀察平板上噬菌斑的形態(tài)特征(如噬菌斑形狀、大小、清亮程度等)。此過程制備的裂解液中往往有多種噬菌體，需進(jìn)一步純化; (4)純化時(shí)，通常采用接種針在單個(gè)噬菌斑中刺一.下，蘸取少許噬菌體接入含有大腸桿菌的液體培養(yǎng)基中,置37°C振蕩培養(yǎng)，直至試管中菌懸液由渾濁變清;培養(yǎng)物經(jīng)離心后取上清液，再重復(fù)步驟(2)、(3)直到出現(xiàn)的噬菌斑形態(tài)一致為止 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 仔細(xì)觀察和比較平板上出現(xiàn)的不同噬菌斑的形態(tài)特性并繪圖 六、注意事項(xiàng) 1.使用儀器要保證是無菌的; 2.注意瓊脂的濃度; 3.氯仿是易燃品，應(yīng)遠(yuǎn)離火焰 |
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