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MDL888

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[交流] 技術(shù)交流｜病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)方法操作步驟-北京百奧思科分享

轉(zhuǎn)染是指將外源基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種生物學(xué)技術(shù)。轉(zhuǎn)染可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類途徑。物理介導(dǎo)方法有電穿孔法、顯微注射和基因槍法,化學(xué)介導(dǎo)方法很多,如磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)技術(shù),生物介導(dǎo)方法,有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染,和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)。

病毒載體是以病毒為基礎(chǔ)進(jìn)行改造而獲得的載體,已經(jīng)成為目前最常用的轉(zhuǎn)染方式之一。通過對病毒基因組進(jìn)行改造,能夠使其攜帶外源的目的基因。將其包裝成病毒顆粒后,通過侵染宿主細(xì)胞,能夠?qū)⑼庠茨康幕蛞徊胨拗骷?xì)胞中。與傳統(tǒng)方法相比,病毒轉(zhuǎn)染在真核細(xì)胞中的效率更高,尤其是在傳統(tǒng)方法難以發(fā)揮作用的哺乳動物實(shí)驗(yàn)中,病毒轉(zhuǎn)染法發(fā)揮著重要的作用。

病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的分類:目前常用的病毒載體包括慢病毒載體、腺病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

慢病毒載體:慢病毒載體是以HIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。和普通逆轉(zhuǎn)錄病毒載體不同的是,它對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均都具有感染能力。慢病毒載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上,從而達(dá)到持久性表達(dá)。

腺病毒載體:腺病毒載體是以腺病毒發(fā)展出的一類載體。和慢病毒載體不同的是,腺病毒載體不會將外源目的基因或自身的病毒基因整合到宿主細(xì)胞的基因組中,而是游離在宿主基因組外獨(dú)立的表達(dá)�；谶@一特性,腺病毒載體能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因的瞬時(shí)表達(dá),同樣也由于不對宿主基因組進(jìn)行整合而避免了潛在的基因突變,具有更好的可控性。

逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體:逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種單鏈RNA病毒,它是能夠在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下將 RNA 轉(zhuǎn)變成 cDNA,再在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等蛋白酶作用下擴(kuò)增的一類病毒。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄病毒的一些特性設(shè)計(jì)出的一種復(fù)制缺陷性病毒,使其成為能夠攜帶某種特異目的基因的表達(dá)載體,即逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法(以慢病毒為例):

慢病毒轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法

1、慢病毒轉(zhuǎn)染前18-24小時(shí),將貼壁細(xì)胞以1×105/孔鋪到24孔板中。使細(xì)胞在慢病毒轉(zhuǎn)染時(shí)的數(shù)量為2×105/孔左右。

2、第二天,用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基,加入適量病毒懸液。37℃孵育。

3、(對polybrene毒性敏感的細(xì)胞選作此步驟)4小時(shí)后加入2ml新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene。

4、繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí),用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基。

5、繼續(xù)培養(yǎng)。如果慢病毒含有熒光蛋白,一般轉(zhuǎn)染48小時(shí)后可見明顯熒光表達(dá),72小時(shí)后更加明顯。如需FACS檢測轉(zhuǎn)染效率,可在轉(zhuǎn)染后72-96小時(shí)進(jìn)行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加藥篩選,可以在轉(zhuǎn)染3-4天后開始加藥。

慢病毒轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法

1、在2×105/ml懸浮細(xì)胞中加入polybrene至6 μg/ml和適量病毒,充分混勻。37℃孵育。或者150g室溫離心4小時(shí)(選作,部分難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系采用此步驟可以提高轉(zhuǎn)染效率)。

2、(對polybrene毒性敏感的細(xì)胞選作此步驟)4小時(shí)后(或離心結(jié)束后)加入等體積新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene。

3、繼續(xù)培養(yǎng)3-4天。中間視細(xì)胞生長情況可傳代或換液。

一定要注意的幾點(diǎn):

感染時(shí)的培養(yǎng)基盡量少些;

2. 每1ml的培養(yǎng)基中加入5-10ul的Polybrene(儲存液濃度為2mg/ml ),可以提高效率約3-5倍。不過病毒感染效率的問題都是相對的,達(dá)到自己的研究目的即可。

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1樓 2021-08-19 08:52:29

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yhk1008

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3樓2021-09-06 00:10:44

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nono20094樓

2021-09-06 18:13 回復(fù)

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jjijjj5樓

2021-09-09 05:32 回復(fù)

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醫(yī)學(xué)生物科研6樓

2021-09-14 15:00 回復(fù)

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