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MDL888新蟲 (初入文壇)
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明膠酶譜法檢測(cè) MMP 活性（實(shí)驗(yàn)方法）-北京百奧思科分享
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細(xì)胞外基質(zhì)( extracellular matrix , ECM )是由大分子構(gòu)成的錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。為細(xì)胞的生存及活動(dòng)提供適宜的場(chǎng)所,并通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)影響細(xì)胞的形狀、代謝、功能、遷移、增殖和分化。 基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)可以降解細(xì)胞外基質(zhì)成份,需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子,是一組具有許多共同生化性質(zhì)的可降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶�；|(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)主要降解IV型膠原,基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)可以降解彈性蛋白、膠原蛋白、明膠和纖維蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的成分�；|(zhì)金屬蛋白酶的失調(diào)是多種疾病發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一。 明膠酶譜實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)MMP2和MMP9的活性,是分子生物學(xué)的常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。先將樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE,含0.1%明膠)電泳分離,然后在有二價(jià)金屬離子存在的緩沖系統(tǒng)中使樣品中的MMP-2和MMP-9恢復(fù)活性,在各自的遷移位置水解凝膠里的明膠,最后用考馬斯亮藍(lán)將凝膠染色,再脫色,在藍(lán)色背景下可出現(xiàn)白色條帶,條帶的強(qiáng)弱與MMP-2和MMP-9活性成正比。 實(shí)驗(yàn)流程如下: 一.樣品制備 組織或細(xì)胞的蛋白樣品制備可用常規(guī)的方法,但需注意蛋白裂解液中不能加入EDTA,因?yàn)镋DTA是金屬離子螯合劑,可以絡(luò)合Zn2+,抑制MMP的活性;也不能加入β-巰基乙醇或DTT,因?yàn)闀?huì)導(dǎo)致蛋白的二硫鍵被打開,蛋白不能復(fù)性。推薦用PBS或Tris緩沖液(pH7.5)作為蛋白提取的緩沖液,可以加入0.5%的PMSF。 二.SDS-PAGE 1)SDS-PAGE 凝膠配制 10%分離膠 5%濃縮膠 總體積 10mL 6mL 30%丙烯酰胺 2.0mL 0.75mL 1.5M Tris-cl (PH 8.8) 2.5mL / 1.0M Tris-cl (PH 6.8) / 0.76mL 10%SDS 0.1mL 0.006μl 10%AP0.1mL0.06mL 0.1mL 0.006μl TEMED 8μl 0.006μl 明膠(10mg/mL) 1.0mL / 超純水 4.5mL 4.5mL 明膠母液配制后可在4℃保存,最好不超過1周。 2)電泳 4℃、常規(guī)電泳即可,可以適當(dāng)延長(zhǎng)電泳時(shí)間,至溴酚藍(lán)完全出膠。上樣量一般為50μg,可根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體情況和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整。 注意:①上樣緩沖液中不能加入β-巰基乙醇或DTT,原因同上。②樣品與上樣緩沖液混合后直接上樣,樣品不要煮沸,高溫會(huì)導(dǎo)致蛋白不可逆的失活。 三.反應(yīng)和顯色 1)將凝膠置于洗脫液(2.5% Triton X-100,50mM Tris-HCl,5mM CaCl2,1μM ZnCl2,pH7. 6)中振蕩洗脫2次,每次40分鐘。 2)漂洗液(50mM Tris-HC,5mM CaCl2,1μM ZnCl2)漂洗2次,每次20分鐘。 3)凝膠置于孵育液(50mM Tris,pH7.5,150mM NaCl,10mM CaCl2,1μM ZnCl2,0.02% Brij-35)中37℃ 孵育42-48小時(shí)。 4)染色液(考馬斯亮藍(lán)染色液)染色3小時(shí)。 染色液配方表 甲醇 乙酸考 馬斯亮藍(lán)(R250) 30% 10 % 0.5% 5)脫色液A、B、C分別脫色。 脫色液配方及脫色時(shí)間 甲醇 乙酸 脫色時(shí)間 A 30% 10 % 0.5小時(shí) B 20% 10 % 1小時(shí) C 10 % 5% 2小時(shí) 脫色時(shí)間可以根據(jù)觀察到的脫色效果調(diào)整。 |
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