 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 2206 | 回復: 2 | |||
| 當前只顯示滿足指定條件的回帖，點擊這里查看本話題的所有回帖 | |||
北京艾柏森鐵蟲 (小有名氣)
|
[交流]
微生物內進行蛋白質表達前需要考慮的8件事 已有2人參與
|
||
|
在微生物內進行蛋白質表達是生物科技中的核心技術。然而，每種蛋白質都具有其獨特的結構性質，比如二硫鍵（disulfide bonds）數(shù)量，是否存在疏水區(qū)域 (hydrophobic regions)，是否存在跨膜區(qū)域 (transmembrane domains)，是否具有糖基化 (glycosylations) 等翻譯后修飾過程等， 所有的這些性質都可能決定著蛋白質表達過程的難易。在與目的蛋白質來源相似的宿主內表達蛋白質要相對容易些。然而，大多時候，我們需要在與蛋白質來源不同的宿主內進行蛋白質的表達，比如在原核細胞內表達真核生物的蛋白質，這通常是具有挑戰(zhàn)性的。在這里，小編與大家分享幾個有助于跨系統(tǒng)實現(xiàn)蛋白質表達的工具。 1. 密碼子優(yōu)化 為了理解密碼子優(yōu)化(codon optimization)的重要性，我們需要首先知道什么是密碼子優(yōu)化。簡單來講，就是在我們構建的載體內引入宿主系統(tǒng)tRNA更愿意讀取的密碼子，這樣能夠更容易將其翻譯成氨基酸，這會提高翻譯速度，提高蛋白質表達的效率。沒錯，我這里用了“更愿意”這樣一個主觀性很強的詞。實際中確實是這樣的，生物系統(tǒng)是具有密碼子偏好性的，不論真核生物還是原核生物，每種生物都會表現(xiàn)出某種程度的密碼子利用的差異和偏愛。這是因為不同生物系統(tǒng)對于特定的密碼子具有不同數(shù)量的可利用的tRNAs，并且每一個系統(tǒng)內對于每一個密碼子，都有特定數(shù)量的tRNAs。所以，如果tRNAs與密碼子數(shù)量的比例不正確，就會阻礙蛋白質的表達。因此，在進行蛋白質表達前，需要根據(jù)表達系統(tǒng)，對目的基因進行密碼子優(yōu)化，使用宿主系統(tǒng)內存在的tRNAs更偏好的密碼子。 2. 純化標簽 當我們在微生物內進行蛋白質的表達時，最后通常都是要對蛋白質進行純化的。當然，如果你只是為了應用全細胞提取物或者裂解提取物，可以不用考慮蛋白質的純化問題。為了實現(xiàn)蛋白質的純化，我們必須為蛋白質加上純化標簽。目前很多純化標簽已經被系統(tǒng)研究并應用于實踐了，常用的純化標簽包括His tag， Strep-II tag， GST， Flat-Tag等。有關蛋白質的純化標簽，大家可以點擊鏈接，查看BioEngX歷史文章。 3. 分子伴侶與折疊酶 表達一個困難的基因就像砸碎一個硬堅果，有時候你需要借助外力。為了獲得一個有用的蛋白，很重要的一點就是保證蛋白質正確折疊。細胞質（cytoplasm）的環(huán)境還原性(reducing)的，這不利于二硫鍵的正確形成，因此會影響蛋白質的折疊。為了輔助蛋白質正確的折疊，防止形成不可溶的包涵體，我們需要表達分子伴侶(chaperones)和折疊酶(foldases)的輔助載體。一些常見的分子伴侶和折疊酶包括DsbA/C, Skp, FkpA, GroEL/ES, DnaK/J/GrpE等。我們可以根據(jù)蛋白質的表達位置，選擇細胞質（cytoplasmic）內分子伴侶或者細胞間質（periplasmic）分子伴侶。另外一些標簽也能夠輔助蛋白質的折疊，比如麥芽糖結合蛋白（maltose binding protein, MBP）。MBP是一個42.5 KDa的蛋白質，能夠與目的蛋白質融合表達，不僅能夠增加蛋白質的可溶性，還能夠輔助蛋白質折疊。MBP的另一個優(yōu)勢是能夠與交聯(lián)淀粉柱（amylose column）結合實現(xiàn)目標蛋白的純化。 4. 蛋白質表達位置 在實驗之前，我們需要考慮蛋白質在哪里表達，是細胞質內（cytoplasm），細胞間質（periplasm）還是細胞外(extracellular)分泌表達。如果一個蛋白質內包含有二硫鍵，我們最好在細胞間質的氧化環(huán)境內令其表達。氧化環(huán)境能夠幫助蛋白質形成正確的二硫鍵從而獲得正確的結構。如果想要蛋白質在細胞內特定的位置表達或分泌到細胞外，需在蛋白質的N端添加信號肽（signal sequence）。在信號肽的幫助下，蛋白質能夠轉移到特定的位置。例如，來自果膠桿菌（Pectobacterium carotovorum）內的PelB信號肽能夠引導蛋白質進入到革蘭氏陰性菌（gram-negative）的細胞間質中。再比如，來自變鉛青鏈霉菌（Streptomyces lividans）內的信號肽能夠將使蛋白質分泌表達到培養(yǎng)基之中。 5. 蛋白質表達通路 蛋白質分泌表達具有很多的優(yōu)勢。一方面分泌表達蛋白質能夠減少對宿主菌的毒性和代謝負擔，使菌適應性增加；另一方面周質空間和胞外培養(yǎng)基中宿主菌蛋白含量很低，有利于目的蛋白的純化。不同的表達途徑對蛋白質的折疊效率有很大的影響。革蘭氏陰性菌共分為5種天然分泌系統(tǒng)，即I型，II型，III型，IV型和V型。 E.coli 主要通過I型和II型系統(tǒng)分泌表達蛋白質。Ⅰ型分泌系統(tǒng)通過α-溶血素途徑直接介導胞外分泌，組成元件簡單，外源重組蛋白與HlyAC-端結合后，再與HlyB/HlyD形成復合物，由ATP水解提供能量，通過TolC通路實現(xiàn)胞外分泌。通過該系統(tǒng)分泌出胞外的蛋白C端仍然帶有一段信號序列，需要在體外進行剪切;此外該系統(tǒng)中的一些共表達部件對目的蛋白的轉運有競爭作用，重組蛋白表達量很低。Ⅱ型分泌系統(tǒng)先介導細胞周質分泌，再經過MTB(main terminal branch)機制實現(xiàn)胞外分泌。分泌蛋白利用以下三種途徑透過細胞質膜: Sec (secretion)通路、信號識別顆粒(signal recognition particle, SRP)通路或雙精氨酸轉移(twin arginine translocation, TAT)通路。三種通路有所不同，Sec通路將蛋白質轉移到周質空間后蛋白質進行折疊，TAT通路卻是將折疊后的蛋白質轉移到細胞周質，而SRP途徑允許蛋白質同時進行折疊與轉移的過程[1]。由于Ecoli跨越內膜的轉運裝置不完善，蛋白輸出能力不夠,蛋白酶降解等原因導致分泌效率低，胞外分泌量往往達不到實驗或工業(yè)生產的要求，目前大腸桿菌的分泌主要是指重組蛋白通過Ⅰ或Ⅱ型系統(tǒng)透過胞質膜分泌至周質腔[2]。 6. 表達菌株 不同的大腸桿菌菌株在培養(yǎng)條件和外源基因表達能力上存在著很大差別，因此不同宿主菌的選擇對表達產物的積累以及下游分離純化有至關重要的作用。利用蛋白酶表達缺陷的突變菌株可以提高重組蛋白的分泌表達量,一些缺陷性菌株(如合成外膜元件的基因突變體)既能夠產生可溶性的、具有正確空間結構和二硫鍵的活性蛋白，又能夠避免細胞壁在外源蛋白跨膜轉運中的阻礙作用，有利于重組蛋白分泌到培養(yǎng)基中。最成功的例子就是L2型細菌(缺乏細胞壁和胞周質)已用于青霉素�；D移酶、鏈激酶、微小抗體的分泌表達中。但因為這些菌株有生長受損性，不能耐受高密度發(fā)酵的過程，L2型細菌不適合工業(yè)化生產�？傊泻芏喾N類的菌株可以用來實現(xiàn)蛋白質的表達。有關大腸桿菌的菌株及表達載體，大家可以從這個網(wǎng)站了解到，www.abiocenter.com。 7. 培養(yǎng)基，溫度，誘導條件等因素 培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)方式、培養(yǎng)條件及培養(yǎng)過程中抑制性代謝產物的積累等都會影響重組蛋白在工程菌中的表達產量和分泌的量。其中培養(yǎng)基營養(yǎng)成分、pH和溫度等參數(shù)是影響工程菌生長和表達外源蛋白的重要因素,能夠影響蛋白酶的活性、分泌和表達水平。向培養(yǎng)基中添加甘氨酸可以在不導致菌體自溶的情況下促進蛋白從周質空間向胞外的分泌,且不引起明顯的細菌裂解。在培養(yǎng)基中添加糖膠和TritonX-100能阻止周間腔中包涵體的形成，并提高胞外表達的效率。改變培養(yǎng)基的滲透壓、短時間的熱沖擊誘導及降低誘導時的溫度,會明顯提高重組蛋白在大腸桿菌的可溶性表達。另外，對于需要IPTG誘導的菌株，誘導時刻，溫度及培養(yǎng)時間必須經過優(yōu)化。 8. 細胞培養(yǎng)時間 合適的細胞培養(yǎng)時間是決定著細胞完整度及蛋白質表達水平的一個重要因素。細胞培養(yǎng)時間過長會導致細胞裂解，目的蛋白丟失，有毒蛋白酶釋放。而細胞培養(yǎng)時間太短的直接后果就是細胞濃度不夠，目標蛋白產率太低。因此重組菌株的培養(yǎng)時間必須經過優(yōu)化。 |
回復此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗中的趣事：實驗器材的 “烏龍”
已經有0人回復
-
不合理蛙科研實驗中的趣事：和實驗材料的 “斗智斗勇”
已經有0人回復
-
化學工程及工業(yè)化學論文潤色/翻譯怎么收費?
已經有74人回復
-
蛋白質檢測：精準分析，解鎖生物分子的密碼
已經有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴謹設計，解析生命機制的重要載體
已經有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準篩查，守護健康與環(huán)境的防線
已經有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經有0人回復
-
納米粒度分析
已經有3人回復
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標南京
已經有0人回復
» 本主題相關商家推薦: (我也要在這里推廣)
克隆超人
銅蟲 (小有名氣)
- 應助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 122.4
- 散金: 3
- 帖子: 59
- 在線: 7.4小時
- 蟲號: 711470
- 注冊: 2009-02-28
- 性別: GG
- 專業(yè): 色譜分析
3樓2022-07-11 09:44:49
菌大大
新蟲 (正式寫手)
- 應助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 2000.2
- 散金: 474
- 紅花: 4
- 沙發(fā): 2
- 帖子: 540
- 在線: 50.5小時
- 蟲號: 5081306
- 注冊: 2016-10-02
- 專業(yè): 環(huán)境微生物學
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
|
我們也遇到過：改變細菌培養(yǎng)基成份，讓滲透壓升高，導致細菌菌體體積變大，約為是平常的2-3倍。不過我們的關注點是細菌的活性和生物量，以及它對污染物的降解效果！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2021-10-17 17:45:23
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 085602高分子方向求調劑 +4 | tlgudy 2026-03-04 | 4/200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 283求調劑 +10 | 鹿沫笙 2026-03-02 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 347求調劑 +6 | 啊歐歐歐 2026-03-03 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 304求調劑 +3 | 曼殊2266 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 中國科學技術大學材料與化工281求調劑，有科研和獲獎經歷 +11 | wsxw 2026-03-02 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 281電子信息求調劑 +5 | jhtfeybgj 2026-03-02 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 304求調劑 +7 | 曼殊2266 2026-02-28 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 320材料與化工，求調劑 +6 | 鶴遨予卿 2026-03-04 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 材料專碩346求調劑 +3 | 旺一下 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料化工調劑 +15 | 今夏不夏 2026-03-01 | 18/900 |
|
|
|
[考研] 一志愿西交大材料學碩 346 求調劑 +3 | zju51 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 281求調劑 +3 | Y?l?h 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0703 總分319求調劑 +4 | Xinyuu 2026-03-02 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 【2026 碩士調劑】課題組 招收調劑生 +3 | 考研版棒棒 2026-03-02 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 求調劑 +11 | yunziaaaaa 2026-03-01 | 13/650 |
|
|
|
[考研] 一志愿華南理工大學材料與化工326分，求調劑 +3 | wujinrui1 2026-02-28 | 3/150 |
|
|
|
[基金申請] 成果系統(tǒng)訪問量大，請一小時后再嘗試。---NSFC啥時候好哦，已經兩天這樣了 +4 | NSFC2026我來了 2026-02-28 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 272求調劑 +6 | 田智友 2026-02-28 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 299求調劑 +3 | Y墨明棋妙Y 2026-02-28 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0856材料求調劑 +4 | 麻辣魷魚 2026-02-28 | 4/200 |
|